一种谷子糯质基因共分离的分子检测方法技术

本发明专利技术涉及谷子检测技术领域，具体的说是一种谷子糯质基因共分离的分子检测方法。具体步骤包括谷子种植、糯质性状鉴定、糯质遗传分析群体、筛选与谷子糯质基因共分离的分子标记、谷子基因组DNA的提取、PCR扩增、电泳与染色和结果确定。本发明专利技术采用分子标记辅助检测，明显缩短了糯质谷子的育种周期,减少了田间工作量,为开展糯谷子自交系选育开辟了一条行之有效的新途径,这对加快糯谷子育种进程和促进糯谷子产业发展有重要的现实意义。

【技术实现步骤摘要】
一种谷子糯质基因共分离的分子检测方法
本专利技术涉及谷子检测
，具体为一种谷子糯质基因共分离的分子检测方法。
技术介绍
谷子属禾本科的一种植物，去皮后俗称小米，广泛栽培于欧亚大陆的温带和热带，中国黄河中上游为主要栽培区。糯性品种的谷子淀粉分子量比普通小米小20多倍，食用消化率比普通小米高20％以上，还具有较高的粘滞性和良好的适口性，制成品有甜香味。加温处理的糯小米淀粉具有较高的膨胀力和透明性，这些优良特征赋予糯小米宝贵的价值和广泛的用途。本专利技术所选的十里香是一种优质糯性谷子资源，但该品种其它农艺性状很差，而豫谷1号则是获国家专利技术奖的优良梗性品种。由豫谷1号×十里香复合杂交选育而成的种子是高产、优质糯性品种，其直链淀粉含量(占样品干重)仅1.22％，在国内谷子糯质品种中含量处于最低水平，表明其为高糯质品种。目前通过豫谷1号×十里香复合杂交而成的种子，主要是利用传统遗传选育技术,其过程繁杂、周期长、效率低。为此，我们推出一种谷子糯质基因共分离的分子检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种谷子糯质基因共分离的分子检测方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种谷子糯质基因共分离的分子检测方法，具体包括以下步骤：S1、谷子种植：(1)从谷子种质资源中选育出优质糯谷子十里香，将其与梗质谷子品种豫谷1号配制正反交杂交组合F1，收获正反交F1后再自交，构建糯质基因的F2分离群体；(2)将F2种植于实验地；>S2、糯质性状鉴定：对亲本十里香和豫谷1号及F1、F2单株进行抗性接种鉴定，每份材料随机取成熟籽粒15粒，分别置于小研钵中用杵子捣碎，加碘-碘化钾溶液(2gKI置于1mL水中，溶解后加入1gI2，震荡至完全溶解，补足蒸馏水至300mL，棕色玻璃瓶中保存，用时将其稀释10倍)30mL，杵子混匀样品和溶液，观察胚乳中淀粉颜色的变化；S3、糯质遗传分析群体：将F2所结的F3种子经过碘液染色，梗质单株与糯质单株的分离比例符合3︰1，说明十里香的糯性由隐形单基因控制；S4、筛选与谷子糯质基因共分离的分子标记：谷子的Waxy基因编码颗粒凝结型淀粉合成酶(GBSS1)，决定谷子胚乳和花粉中的直链淀粉合成。普通谷子(WxWx)籽粒中的淀粉由直链淀粉和支链淀粉组成，糯谷子(wxwx)籽粒中含有少量或不含直链淀粉，几乎全部由支链淀粉组成。因为不同转座子插入GBSS1基因序列的不同位点，Waxy基因突变成各种不同的等位基因，减弱或消除了GBSS1基因的表达，对其编码蛋白颗粒凝结型淀粉合成酶的酶活影响界于5％至95％之间，从而形成糯质(waxy)或低淀粉含量(low-amylose)性状，利用转座子TSI-2序列和GBSS1内含子1序列，设计一对InDel标记引物waxy-TSI2/int1，可以鉴别出Ⅳ型糯质纯合隐性和杂合显性基因型；利用TSI-2插入位点所在的内含子1序列，又设计了一对InDel标记引物waxy-int1-1F/4R，可以鉴别梗质纯合和杂合基因型，即二对引物同时使用能够排除Ⅳ型糯质基因型中杂合基因型的干扰，二对InDel标记引物序列如下，waxy-TSI2/int1标记的引物核酸碱基序列是：上游引物：5’GAAGTGGAGGATACTGATGGG3’下游引物：5’GGATTTGACTGCATGAAAATG3’waxy-int1-1F/4R标记的引物核酸碱基序列是：上游引物：5’CCGTTTCGGTCGGTAGGAAG3’下游引物：5’AGTGGGTTCGATGTTTGAAC3’将合成的引物用双蒸水稀释为10μM，-20℃保存备用；S5、谷子基因组DNA的提取：(1)在F2幼苗期选择茁壮、无病害的单株取样，每株剪一片嫩叶分别放入取样袋并编号置于冰盒存储；(2)采用CTAB方法，取5-7cm长叶片于1.5mlPCR管，编号后放入液氮缸，用镊子夹出PCR管，将谷子叶片迅速研磨成粉末状；(3)将粉末转移到1.5mL离心管中，加入CTAB提取缓冲液650μL，CTAB提取缓冲液事先在65℃水浴，充分振荡、混匀，使粉末均匀分散于提取液中,65℃水浴40min；(3)冷却至室温后，加入等体积的氯仿:异戊醇24:1，充分混匀，于10000rpm离心10min；(4)取上清，转入新1.5mL离心管中，加入等体积的氯仿︰异戊醇24:1，充分混匀,于1000rpm离心10min；(5)取上清，转入新1.5mL离心管中，加入650μL-20℃预冷的异丙醇，摇匀，自由沉淀30min，于10000rpm离心10min；(6)弃上清，用75％乙醇洗涤沉淀2次；(7)弃75％乙醇，DNA沉淀风干后，溶解于200μL的TE溶液，TE中EDTA与Tris的摩尔比是1/10，4℃保存备用，用0.8％的琼脂糖电泳检测DNA样品质量；S6、PCR扩增：以提取的DNA基因组为模板，按下列反应体系进行PCR，PCR反应体系(20μL)为：100ng基因组DNA模板、400μMdNTPs、1×PCRbuffer、各0.5μM上下游引物，1.5UTaqDNA聚合酶，补纯水至20μL；S7、电泳与染色：在各个PCR产物中分别加入6μL上样缓冲液，用1.2％琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色，凝胶成像系统拍照后保存；S8、确定结果：利用二对标记引物对“十里香/豫谷1号”F2群体单株进行PCR分析。作为本技术方案的进一步优化，在步骤S4中，PCR扩增条件为：94℃预变性2.5min，随后94℃30s，55℃30s，72℃30s，循环35次，最后在72℃延伸20min。本专利技术提供的一种谷子糯质基因共分离的分子检测方法。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术采用分子标记辅助检测，明显缩短了育种周期,减少了田间工作量,为开展糯谷子自交系选育开辟了一条行之有效的新途径,这对加快糯谷子的育种进程和促进糯谷子产业的发展有重要的现实意义。具体实施方式下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术提供一种技术方案：一种谷子糯质基因共分离的分子检测方法，具体包括以下步骤：S1、谷子种植：(1)从谷子种质资源中选育出优质糯谷子十里香，将其与梗质谷子品种豫谷1号配制正反交杂交组合F1，收获正反交F1后再自交，构建糯质基因的F2分离群体；(2)将F2种植于实验地；S2、糯质性状鉴定：对亲本十里香和豫谷1号及F1、F2单株进行抗性接种鉴定，每份材料随机取成熟籽粒15粒，分别置于小研钵中用杵子捣碎，加碘-碘化钾溶液(2gKI置于1mL水中，溶解后加入1gI2，震荡至完全溶解，补本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种谷子糯质基因共分离的分子检测方法，其特征在于：具体包括以下步骤：/nS1、谷子种植：/n(1)从谷子种质资源中选育出优质糯谷子十里香，将其与梗质谷子品种豫谷1号配制正反交杂交组合F1，收获正反交F1后再自交，构建糯质基因的F2分离群体；/n(2)将F2种植于实验地；/nS2、糯质性状鉴定：/n对亲本十里香和豫谷1号及F1、F2单株进行抗性接种鉴定，每份材料随机取成熟籽粒15粒，分别置于小研钵中用杵子捣碎，加碘-碘化钾溶液(2g KI置于1mL水中，溶解后加入1gI

【技术特征摘要】
1.一种谷子糯质基因共分离的分子检测方法，其特征在于：具体包括以下步骤：
S1、谷子种植：
(1)从谷子种质资源中选育出优质糯谷子十里香，将其与梗质谷子品种豫谷1号配制正反交杂交组合F1，收获正反交F1后再自交，构建糯质基因的F2分离群体；
(2)将F2种植于实验地；
S2、糯质性状鉴定：
对亲本十里香和豫谷1号及F1、F2单株进行抗性接种鉴定，每份材料随机取成熟籽粒15粒，分别置于小研钵中用杵子捣碎，加碘-碘化钾溶液(2gKI置于1mL水中，溶解后加入1gI2，震荡至完全溶解，补足蒸馏水至300mL，棕色玻璃瓶中保存，用时将其稀释10倍)30mL，杵子混匀样品和溶液，观察胚乳中淀粉颜色的变化；
S3、糯质遗传分析群体：
将F2所结的F3种子经过碘液染色，梗质单株与糯质单株的分离比例符合3︰1，说明十里香的糯性由隐形单基因控制；
S4、筛选与谷子糯质基因共分离的分子标记：
谷子的Waxy基因编码颗粒凝结型淀粉合成酶(GBSS1)，决定谷子胚乳和花粉中的直链淀粉合成。普通谷子(WxWx)籽粒中的淀粉由直链淀粉和支链淀粉组成，糯谷子(wxwx)籽粒中含有少量或不含直链淀粉，几乎全部由支链淀粉组成。因为不同转座子插入GBSS1基因序列的不同位点，Waxy基因突变成各种不同的等位基因，减弱或消除了GBSS1基因的表达，对其编码蛋白颗粒凝结型淀粉合成酶的酶活影响界于5％至95％之间，从而形成糯质(waxy)或低淀粉含量(low-amylose)性状，利用转座子TSI-2序列和GBSS1内含子1序列，设计一对InDel标记引物waxy-TSI2/int1，可以鉴别出Ⅳ型糯质纯合隐性和杂合显性基因型；利用TSI-2插入位点所在的内含子1序列，又设计了一对InDel标记引物waxy-int1-1F/4R，可以鉴别梗质纯合和杂合基因型，即二对引物同时使用能够排除Ⅳ型糯质基因型中杂合基因型的干扰，二对InDel标记引物序列如下，
waxy-TSI2/int1标记的引物核酸碱基序列是：
上游引物：5’GAAGTGGAGGATACTGATGGG3’
下游引物：5’GGATTTGACTGCATGAAAATG3’
waxy-int1-1F/4R标记的引物核酸碱基序列是：
...

【专利技术属性】
技术研发人员：周国艳，于雄胜，史晓晶，梁彬，
申请(专利权)人：忻州师范学院，
类型：发明
国别省市：山西;14