2-脱氧-3脱氧磷酸葡萄糖酸醛缩酶在控制1-脱氧野尻霉素产量中的应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程领域，具体涉及2‑脱氧‑3脱氧磷酸葡萄糖酸醛缩酶在控制1‑脱氧野尻霉素产量中的应用，本发明专利技术通过基因工程的方法敲除了解淀粉芽胞杆菌LX‑12的基因组内的

【技术实现步骤摘要】
2-脱氧-3脱氧磷酸葡萄糖酸醛缩酶在控制1-脱氧野尻霉素产量中的应用
本专利技术属于微生物遗传育种领域，具体涉及2-脱氧-3脱氧磷酸葡萄糖酸醛缩酶在控制1-脱氧野尻霉素产量中的应用，本专利技术通过敲除2-脱氧-3脱氧磷酸葡萄糖酸醛缩酶提高了解淀粉芽胞杆菌1-脱氧野尻霉素产量，为解淀粉芽胞杆菌高产1-脱氧野尻霉素提供了一种策略。
技术介绍
随着人们生产生活方式的改变和发展，糖尿病已经成为继心脑血管疾病和肿瘤之后威胁人类的第三号杀手，对全球的健康和经济带来了重大的威胁，在亚洲尤其是中国地区这一问题尤为严重。1-脱氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin)一种多羟基哌啶类生物碱，具有较强的α-葡萄糖苷酶抑制活性。因此，1-脱氧野尻霉素及其衍生物作为高效的糖苷酶抑制剂，在药物开发中受到广泛重视。在之前的研究中，1-脱氧野尻霉素大多从桑叶中提取，其成本高、不利于产业化生产，因此利用微生物合成1-脱氧野尻霉素已成为当今研究热点。然而，目前微生物合成1-脱氧野尻霉素的产量低，还不能满足市场的需求。KdgA编码2-脱氧-3脱氧磷酸葡萄糖酸醛缩酶，其在解淀粉芽胞杆菌中的调控网络和调控具体的基因还没有相关报道。本专利通过敲除解淀粉芽胞杆菌LX-12中2-脱氢-3-脱氧磷酸葡萄糖醛酸醛缩酶基因kdgA，使其在解淀粉芽孢杆菌中不表达，提高了解淀粉芽胞杆菌1-脱氧野尻霉素的产量。本专利技术首次通过敲除2-脱氢-3-脱氧磷酸葡萄糖醛酸醛缩酶基因kdgA来提高1-脱氧野尻霉素产量，为1-脱氧野尻霉素高产提供一种新方法。r>
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供敲除、失活或降低2-脱氧-3脱氧磷酸葡萄糖酸醛缩酶的活力在提高解淀粉芽胞杆菌发酵生产1-脱氧野尻霉素的能力中的应用，所述酶的氨基酸序列为SEQIDNO.2所示。为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施：敲除、失活或降低2-脱氧-3脱氧磷酸葡萄糖酸醛缩酶的活力在提高解淀粉芽胞杆菌发酵生产1-脱氧野尻霉素的能力中的应用，包括利用本专利技术的常规技术，将解淀粉芽胞杆菌中编辑2-脱氧-3脱氧磷酸葡萄糖酸醛缩酶的kdgA基因敲除、突变或沉默，以降低或者失活其酶活力，敲除后的菌株提高解淀粉芽孢杆菌1-脱氧野尻霉素的发酵生产产量，所述酶的氨基酸序列为SEQIDNO.2所示；所述的解淀粉芽胞杆菌为生产1-脱氧野尻霉素的菌株。以上所述的应用中，优选的，所述的解淀粉芽胞杆菌LX-12的保藏编号为CCTCCNO：M2015234。以上所述的应用中，解淀粉芽胞杆菌基因kdgA的敲除方法，包括以下步骤：(1)以解淀粉芽胞杆菌LX-12(CCTCCNO：M2015234)的基因组DNA为模板，PCR扩增出kdgA基因的上游同源臂和kdgA基因的下游同源臂；(2)通过重叠延伸PCR将kdgA基因的上游同源臂和kdgA基因的下游同源臂连接到一起，构成目的基因片段；(3)采用SacI和XbaI限制性内切酶对目的基因片段进行双酶切得到酶切基因片段；(4)采用SacI和XbaI限制性内切酶对质粒T2(2)-ori进行双酶切得到线性质粒片段；(5)将步骤(3)得到的酶切基因片段和步骤(4)得到的线性质粒片段经DNA连接酶进行连接，得到敲除质粒T2(2)-ΔkdgA；(6)将敲除质粒T2(2)-ΔkdgA转入解淀粉芽胞杆菌LX-12中，以卡那青霉素作为筛选标记，筛选得到阳性转化子；(7)将阳性转化子转接培养数次后，进行菌落PCR检测，得到kdgA基因的上游同源臂或kdgA基因的下游同源臂与解淀粉芽胞杆菌LX-12基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株；(8)挑选kdgA基因的上游同源臂与解淀粉芽胞杆菌LX-12基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株与kdgA基因的下游同源臂与解淀粉芽胞杆菌LX-12基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株混合接种于不含有卡那青霉素的培养基中经过数次转接培养，PCR法筛选得到敲除了kdgA基因的解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)LX-12ΔkdgA；以上所述的应用中，优选的，在应用过程中以敲除了kdgA基因的解淀粉芽胞杆菌工程菌株发酵生产1-脱氧野尻霉素时，其发酵培养基配方为：60-100g/L豆粕；50-80g/L玉米淀粉；0.5-1.0g/LKH2PO4；0.3-0.6g/LMgSO4·7H2O；0.1-0.3g/LFeSO4·7H2O；0.01-0.05g/LMnSO4·H2O，其余为水。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：与解淀粉芽胞杆菌LX-12相比，通过本专利技术构建得到的解淀粉芽胞杆菌LX-12ΔkdgA的1-脱氧野尻霉素产量提高了20％以上。本专利技术的研究结果表明：敲除解淀粉芽胞杆菌LX-12基因组DNA中的kdgA基因为提高1-脱氧野尻霉素产量提供了一种新的方法。附图说明图1为实施例1步骤(1)得到的kdgA基因上游同源臂和kdgA基因下游同源臂的琼脂糖凝胶图；其中，泳道M为DNAmarker，泳道1为kdgA基因的上游同源臂，泳道2为kdgA基因的下游同源臂。图2为实施例1步骤(5)得到的敲除质粒T2(2)-ΔkdgA进行菌落PCR验证图；其中，泳道M为DNAmarker，泳道1为敲除质粒T2(2)-ΔkdgA进行菌落PCR验证的条带。图3为实施例1步骤(8)得到的敲除了kdgA基因的解淀粉芽胞杆菌LX-12ΔkdgA的验证条带。其中，泳道M为DNAmarker，泳道1为解淀粉芽胞杆菌LX-12ΔkdgA的验证条带，泳道2为解淀粉芽胞杆菌LX-12的对照条带。其中，上述DNAmarker泳道中从上到下的条带对应的分子量依次为：5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。具体实施方式以下实施例是对本专利技术的进一步说明，而不是对本专利技术的限制。本专利技术所述技术方案，如未特别说明，为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。本专利技术是以敲除解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)LX-12的kdgA基因为例，来证实2-脱氧-3脱氧磷酸葡萄糖酸醛缩酶在控制1-脱氧野尻霉素产量中的效果；其他本领域的常规方式，例如kdgA基因siRNA，kdgA基因RNAi慢病毒、kdgA基因突变的方式，只要能将2-脱氧-3脱氧磷酸葡萄糖酸醛缩酶的酶活丧失或者下降，都能提高解淀粉芽孢杆菌生产1-脱氧野尻霉素的能力。上述解淀粉芽孢杆菌指得是野生型就能产1-脱氧野尻霉素的菌株。实施例1：kdgA基因缺失的解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)LX-12ΔkdgA的获得：所述的kdgA基因的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示，编码的蛋白质为SEQIDNO.2所示。(本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.敲除、失活或降低2-脱氧-3脱氧磷酸葡萄糖酸醛缩酶的活力在提高解淀粉芽胞杆菌发酵生产1-脱氧野尻霉素的能力中的应用，所述的解淀粉芽胞杆菌为生产1-脱氧野尻霉素的菌株，所述酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。/n

【技术特征摘要】
1.敲除、失活或降低2-脱氧-3脱氧磷酸葡萄糖酸醛缩酶的活力在提高解淀粉芽胞杆菌发酵生产1-脱氧野尻霉素的能力中的应用，所述的解淀粉芽胞杆菌为生产1-脱氧野尻霉素的菌株，所述酶的氨基酸序列为SEQIDNO.2所示。


2.根据权利要求1所述的应用，所述的解淀粉芽胞杆菌的保藏编号为CCTCCNO：M2015234。


3.根据权利要求1所述的应用，应用过程包括：
（1）以保藏编号为CCTCCNO：M2015234的解淀粉芽胞杆菌LX-12的基因组DNA为模板，PCR扩增出kdgA基因的上游同源臂和kdgA基因的下游同源臂；
（2）通过重叠延伸PCR将kdgA基因的上游同源臂和kdgA基因的下游同源臂连接到一起，构成目的基因片段；
（3）采用SacI和XbaI限制性内切酶对目的基因片段进行双酶切得到酶切基因片段；
（4）准备质粒T2(2)-ori，并采用SacI和XbaI限制性内切酶对质粒T2(2)-ori进行双酶切得到线性质粒片段；
（5）将步骤（3）得到的酶切基因片段和步骤（4）得到的线性质粒片段经DNA连接酶进行连接，得到敲除质粒T2(2)-ΔkdgA；
（6）将敲除质...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈守文，蔡冬波，芦玉，冀志霞，马昕，陈建刚，李鑫，
申请(专利权)人：武汉骏安生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42