猪星状病毒间接ELISA检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种猪星状病毒间接ELISA检测试剂盒，包括预先包被的ELISA反应板，预先包被的ELISA反应板以猪星状病毒Capside保守区蛋白(pGEX‑4T‑1‑cap‑1蛋白)作为包被抗原。试验证明，本发明专利技术猪星状病毒间接ELISA检测试剂盒，能准确灵敏地检测猪血清中的性抓个病毒抗体，从而对样品进行定性判断。而且，样品前处理过程简单，耗时少，敏感性好，能同时检测大量的样品，样品检测成本远低于传统的仪器检测方法。综上，本发明专利技术对解决大批量样品的猪星状病毒现场检测技术具有重要的现实意义。

【技术实现步骤摘要】
猪星状病毒间接ELISA检测试剂盒
本专利技术属于猪星状病毒检测
，尤其涉及一种猪星状病毒间接ELISA检测试剂盒。
技术介绍
近年来在国内外的养殖场中，猪星状病毒(porcineastrovirus，PAstV)常与其他肠道病毒混合感染引起仔猪腹泻，并造成不小的经济损失。PAstVCapside可以刺激机体产生免疫应答，是研究检测诊断试剂的首选蛋白。猪星状病毒的诊断较为常见的方法有流行病学、分子诊断及病毒分离诊断等，但这些方法中有的诊断时间较长，有的检测结果不理想，有的不便于临床大量检测。ELISA方法具有快速定性和定量、灵敏度高、适用范围广、结果判定客观、成本低和可同时进行数千份样品的检测等优点。目前，国内外并没有关于猪星状病毒相关ELISA检测试剂盒的产品报道。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种具有高特异性、高灵敏度、高准确度、高精确度、操作简单的星状病毒间接ELISA检测试剂盒，以便于实现猪星状病毒的批量、快速血清学检测。为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：猪星状病毒间接ELISA检测试剂盒，包括预先包被的ELISA反应板，预先包被的ELISA反应板以猪星状病毒Capside保守区蛋白作为包被抗原。猪星状病毒Capside保守区蛋白由序列表SEQ.ID.No.1的基因碱基序列编码或者具有SEQ.ID.No.2的氨基酸序列。上述猪星状病毒间接ELISA检测试剂盒，还包括标准阴性血清、标准阳性血清、辣根过氧化物酶HRP标记山羊抗猪IgG、洗涤液、稀释液、包被液、封闭液、底物液、终止液。洗涤液和稀释液均为PBST洗涤液；包被液为PH9.6Na2CO3-NaHCO3缓冲液；封闭液为5％胎牛血清；底物液为TMB显色液；终止液为2mol/L的硫酸溶液。洗涤液和稀释液均为PBST洗涤液，按以下进行配制：将准确称量的8gNaCl、0.2gKCl、2.9gNa2HPO4.12H2O和0.2gKH2PO4充分溶解在800mL去离子水中，然后将pH值调节到7，然后加去离子水定容至1L，再加入500μLTween-20；包被液为pH9.6Na2CO3-NaHCO3缓冲液，按以下进行配制：将1.59gNa2CO3和2.93gNaHCO3加水充分溶解后，将pH调到9.6后，加去离子水定容为1L，即得；底物液为TMB显色液，包括TMB显色A液和B液，使用前进行1：1配制。包被抗原按以下方法进行制备：根据猪星状病毒全长感染性克隆质粒为模板，利用设计合成的特异性引物对猪星状病毒I型Capsid基因保守区进行PCR扩增，并将目的基因回收连接到pGEX-4T-1质粒中，经鉴定后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，IPTG诱导后采用SDS-PAGE分析蛋白质的表达情况；亲和层析法分离纯化得到目的蛋白pGEX-4T-1-cap-1蛋白。特异性引物包括序列表SEQ.ID.No.3和SEQ.ID.No.4的碱基序列。预先包被的ELISA反应板按以下方法进行制备：取100μl用包被液稀释至工作浓度的包被抗原加入ELISA反应板的反应孔中，37℃包被2h，用100μl封闭液37℃封闭2小时；工作浓度为200μg/孔。针对目前现有猪星状病毒诊断检测存在的问题，专利技术人设计并制备了一种猪星状病毒间接ELISA检测试剂盒，包括预先包被的ELISA反应板，预先包被的ELISA反应板以猪星状病毒Capside保守区蛋白(pGEX-4T-1-cap-1蛋白)作为包被抗原。其分析原理是：酶标板上的每个孔均包被有相同量的抗原，加入稀释好的待测样品(血清)，样品中的capside抗体能够通过抗原抗体反应给合到固相上，再加入酶标二抗，当样品中的针对pGEX-4T-1-cap-1蛋白的抗体浓度高的时候，结合的抗体就越多，结合的酶标二抗体就越多，用洗涤液洗涤后加入显色液，显色反应就越深，用酶标仪检测的OD值越高，表明待测样品中的capside抗体含量越高，当反应的OD值高于临界值时，就判定为阳性；反之，则为阴性。该试剂盒涉及星状病毒衣壳蛋白作为星状病毒唯一的结构蛋白，不仅是病毒刺激受感染机体产生保护性免疫反应的主要因素，也是该病毒的抗原蛋白。专利技术人前期研究表明，在猪星状病毒衣壳蛋白序列中，1aa-419aa区间相对保守，对其进行抗原表位预测，发现1aa-150aa存在抗原表位的可能性较高，因此选取该蛋白相对保守的1aa-150aa片段进行扩增，克隆表达猪星状病毒衣壳蛋白保守区片段并建立相应的间接ELISA检测方法能够更特异、灵敏地判断是否存在猪星状病毒感染和定量感染后引起的抗体滴度，可以为猪星状病毒的血清学早期诊断提供一种快速准确的方法。试验证明，本专利技术猪星状病毒间接ELISA检测试剂盒，能准确灵敏地检测猪血清中的性抓个病毒抗体，从而对样品进行定性判断。而且，样品前处理过程简单，耗时少，敏感性好，能同时检测大量的样品，样品检测成本远低于传统的仪器检测方法。综上，本专利技术对解决大批量样品的猪星状病毒现场检测技术具有重要的现实意义。附图说明图1是cap-1扩增结果图，图中：M是DL1000DNAMarker；1-3是cap-1片段；4是阴性对照。图2是重组质粒的酶切鉴定结果图，图中：M是DL5000DNAMarker；1是pGEX-4T-1-cap-1重组质粒；2是pGEX-4T-1空载。图3是重组蛋白表达结果图，图中：M是Marker；1是pGEX-4T-1-cap-1重组蛋白；2是pGEX-4T-1空载。图4是重组蛋白表达形式确定结果图，图中：M是Marker；1是pGEX-4T-1-cap-1诱导上清；2是pGEX-4T-1-cap-1诱导沉淀。图5是重组蛋白纯化结果图，图中：M是Marker；1是流穿液；2是洗涤液；3是洗脱液。图6是重组蛋白透析后WB验证结果图，图中：M是Marker；1是透析后蛋白；2是pGEX-4T-1空载对照。具体实施方式一、材料和方法菌株和质粒：猪星状病毒全长感染性克隆质粒、pGEX4T-1表达载体质粒由广西大学动物科学技术学院传染病与分子免疫学实验室制备并保存，SeamLessCloningandAssemblyKit和Trans5a、BL21(DE3)感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司。试剂：PrimeSTARMax酶、DL2000Marker和限制性内切酶BamHI、购自大连宝生物制品有限公司；质粒小提试剂盒、普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；IPTG、蛋白上样缓冲液、蛋白Marker购自碧云天生物技术公司。二、重组表达质粒pGEX-4T-1-cap-1的构建及鉴定根据已知的保守区序列，结合表达载体pGEX-4T-1多克隆酶切位点，运用Vazyme公司开发的CEDesignV1.04引物设计软件，设计扩增保守区片段的特异性引物，引物序列如表1。表1引物序本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猪星状病毒间接ELISA检测试剂盒，包括预先包被的ELISA反应板，其特征在于：所述预先包被的ELISA反应板以猪星状病毒Capside保守区蛋白作为包被抗原。/n

【技术特征摘要】
1.一种猪星状病毒间接ELISA检测试剂盒，包括预先包被的ELISA反应板，其特征在于：所述预先包被的ELISA反应板以猪星状病毒Capside保守区蛋白作为包被抗原。


2.根据权利要求1所述的猪星状病毒间接ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述猪星状病毒Capside保守区蛋白由序列表SEQ.ID.No.1的基因碱基序列编码或者具有SEQ.ID.No.2的氨基酸序列。


3.根据权利要求1所述的猪星状病毒间接ELISA检测试剂盒，其特征在于还包括标准阴性血清、标准阳性血清、辣根过氧化物酶HRP标记山羊抗猪IgG、洗涤液、稀释液、包被液、封闭液、底物液、终止液。


4.根据权利要求3所述的猪星状病毒间接ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述洗涤液和稀释液均为PBST洗涤液；所述包被液为PH9.6Na2CO3-NaHCO3缓冲液；所述封闭液为5％胎牛血清；所述底物液为TMB显色液；所述终止液为2mol/L的硫酸溶液。


5.根据权利要求4所述的猪星状病毒间接ELISA检测试剂盒，其特征在于：
所述洗涤液和稀释液均为PBST洗涤液，按以下进行配制：将准确称量的8gNaCl、0.2gKCl、2.9gNa2HPO4.12H2O和0.2gKH2PO4充分溶解在800mL去离子水中，然后将pH值调节到7，然后加去离子水定容至1L，再加入500...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄伟坚，王蔚怡，刘欢，郑瑞程，张文超，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：广西;45