核酸分子在植物转基因、分子育种、病害防治和分子标记物中的用途制造技术

本发明专利技术公开核酸分子在植物转基因、分子育种、病害防治和分子标记物中的用途。本发明专利技术通过基因工程使编码去环氧基蛋白酶的核酸分子在植物内表达，从而高效去除单端孢霉烯族毒素的环氧基，直接减少植物体内毒素含量，同时还可提高作物的抗病能力，显著提高作物品质。本发明专利技术弥补了目前尚未有明确的基因可通过去环氧基催化单端孢霉烯族毒素进行解毒的空白，在植物转基因、分子育种、病害防治方面具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
核酸分子在植物转基因、分子育种、病害防治和分子标记物中的用途
本专利技术涉及分子植物学领域，具体地涉及一种核酸分子在植物转基因、分子育种、病害防治和分子标记物中用途。
技术介绍
镰刀菌属(Fusariumsp.)是一类世界性分布的真菌，它不仅可以在土壤中越冬越夏，还可侵染多种植物(粮食作物、经济作物、药用植物及观赏植物)，引起植物的根腐、茎腐、茎基腐、花腐和穗腐等多种病害，寄主植物达100余种，侵染寄主植物维管束系统，破坏植物的输导组织维管束，并在生长发育代谢过程中产生毒素危害作物，造成作物萎蔫死亡，影响产量和品质，是生产上防治最艰难的重要病害之一。受镰刀菌侵染的植物或籽粒中含有多种霉菌毒素，主要有单端孢霉烯族化合物(trichothecenes，CTCs)、玉米赤霉烯酮(zearalenone)、丁烯酸内酯(butenolide)和伏马菌素(fumonisinsFB)等毒素。由禾谷镰刀菌(主要包括F.asiaticum、F.graminearumSchwabe和F.pseudograminearum)侵染谷物引起的病害主要包括小麦、大麦、燕麦、玉米和谷子的赤霉病和茎基腐病。当前无论是小麦、大麦还是玉米赤霉病都是世界性难以解决的重大真菌病害。例如，由小麦赤霉病导致的谷物减产和籽粒霉菌毒素污染已成为我国及世界范围内最亟待解决的粮食安全问题之一。禾谷镰刀菌在小麦杨花期侵染小麦穗部，分泌大量单端孢霉烯族毒素从而显著增加病原菌的致病性，导致对产量造成毁灭性的破坏。同时食用受到该类毒素污染的小麦籽粒后会导致食欲减退或废绝、胃肠炎症和出血、呕吐、腹泻、坏死性皮炎、运动失调、血凝不良、贫血和白细胞数量减少、免疫机能降低和流产等，严重威胁人畜健康。
技术实现思路
鉴于现有技术存在的问题，专利技术人提供一种编码去环氧基蛋白酶的核酸分子，通过该核酸可有效去除毒素中的环氧基，从而实现解毒。基于此完成了本专利技术。具体地，本专利技术包括以下内容。本专利技术的第一方面，提供核酸分子在植物转基因、分子育种、病害防治和分子标记物中用途，所述核酸分子具有选自下述(a)-(e)组成的组中的一种碱基序列：(a)SEQIDNo.:1-35所示的序列；(b)在(a)中碱基序列的基础上经宿主密码子偏好性改造的序列；(c)(a)中所示序列的保守区序列；(d)与(a)-(c)的序列同一性为95％以上且来源于相同属的序列；(e)与(a)-(d)任一序列的至少一部分互补的序列。在(a)的序列中，SEQIDNo.1表示来源于长穗偃麦草十倍体的去环氧酶基因，SEQIDNo.2表示来源于长穗偃麦草二倍体的去环氧酶基因。SEQIDNo.:3-24表示SEQIDNo.1序列的突变体。SEQIDNo.:25-35表示来源于香柱菌属(属)不同物种的同源基因序列。本专利技术中，在(b)的序列中，经宿主密码子偏好性改造是指为了适应于不同宿主表达的需要，根据简并密码子来对(a)中的碱基序列进行碱基替换。密码子偏好性改造一般不改变产物蛋白或多肽的序列。在(c)的序列中，保守区序列是指在长穗偃麦草属和香柱菌属的不同物种内对应的序列同一性为98％以上，优选99％以上，更优选100％一致的区域。保守区序列还可以指在长穗偃麦草属内不同物种的序列同一性为100％的部分连续区域，也可以指在香柱菌属的不同物种内对应的序列同一性为100％的部分连续区域。保守区序列可以对应于活性多肽的保守区氨基酸序列。需要说明的是，碱基的保守区序列并不一定表达或编码活性多肽。只要其为保守区即可用作检测靶标。在某些实施方案中，当以SEQIDNo.1所示的碱基序列作为位置参考时，所述核酸分子包含至少一种选自以下的碱基序列：第436-470位之间的碱基序列、第430-476位之间的碱基序列、第808-846位之间的碱基序列。在(d)的序列中，与(a)-(c)中的碱基序列的序列同一性一般为90％以上，优选95％以上，更优选97％以上，还优选98％以上，进一步优选99％以上。一般而言，(d)中的序列在序列同一性的基础上来源于相同属，优选来源于相同物种的碱基序列。在某些实施方案中，该核酸分子的碱基序列与(a)、(b)或(c)中的氨基酸序列的序列同一性为95％以上，且均来源于长穗偃麦草属或香柱菌属。在(e)序列中，与(a)-(d)中任一序列的至少一部分互补的序列，其中互补的序列包括在严格条件下与这些序列特异性杂交的序列。例如，探针、引物等。具有这些序列的核酸分子或寡核苷酸分子的长度不特别限定，可以是15-200bp，例如，15-40bp，150-180bp等。在某些具体实施方案中，所述核酸分子能够编码具有去环氧催化活性的蛋白酶。本专利技术中的植物不特别限定，可以是粮食作物、经济作物、药用植物等，也可以是草本植物也可以是木本植物。作为粮食作物实例包括但不限于例如大米、小麦、大麦、水稻、青稞、小米、大豆等。作为木本植物的实例包括果树，例如木本常绿果树或蔷薇科果树。植物的实例还包括紫花苜蓿、偃麦草、黑麦草、墨西哥玉米草、皇竹草牧草、甜象草牧草、大麦、花生、棉花等。本专利技术的植物还可以是杂交植物。例如由上述植物杂交得到的植物。在某些具体实施方案中，所述病害包括镰刀菌属、头孢菌属、漆班菌属或木霉属的细菌引起的植物病害。此类植物病害可举例例如根腐、茎腐、茎基腐、花腐和穗腐。本专利技术的第二方面，提供一种植物细胞，其包含通过基因工程手段引入具有选自(a)-(e)组成的组中的一种碱基序列的外源核酸分子。本专利技术的第三方面，提供一种转基因植物，所述转基因植物通过基因工程手段将外源核酸导入宿主植物而得到。本专利技术的核酸分子能够编码去环氧基蛋白酶，从而使转基因植物具有了针对单端孢霉烯族化合物的环氧基去除能力，进而降低植物内此类毒素的含量。此类毒素的实例包括但不限于脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)、15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15-ADON)、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-ADON)、雪腐镰刀菌烯醇(NIV)、镰刀菌烯酮-X(Fus-X)、二乙酰氧基草镰刀菌烯醇(DAS)、T-2毒素(T-2)、HT-2毒素(HT-2)。附图说明图1为LC-HRMS全扫模式下的禾谷镰孢菌(F.g)侵染转基因小麦提取的离子色谱图。图2为LC-HRMS(/MS)PRM模式下F.g侵染转基因小麦提取的离子色谱图。图3为LC-HRMS(/MS)PRM模式对毒素及其衍生物定量检测结果。其中，(a)表示DON-GSH定量结果；(b)表示DON定量结果；(c)表示3-ADON-GSH定量结果；(d)表示3-ADON定量结果。图4为转基因植株抗赤霉病表型鉴定实验的结果。其中图(a)为接种21d发病情况(图中A表示转基因阳性植株，B表示转基因受体材料)；(b)为转ThFhb7过量表达3个株系发病小穗数统计；(c)为转ThFhb7原始表达3个株系发病小穗数统计。图5为ThFhb7转基因株系对镰孢菌种的广泛抗性结果。其中，(a)表示ThFhb本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.核酸分子在植物转基因、分子育种、病害防治和分子标记物中的用途，其特征在于，所述核酸分子具有选自下述(a)-(e)组成的组中的一种碱基序列：/n(a)SEQ ID No.:1-35所示的序列；/n(b)在(a)中碱基序列的基础上经宿主密码子偏好性改造的序列；/n(c)(a)中所示序列的保守区序列；/n(d)与(a)-(c)的序列同一性为95％以上且来源于相同属的序列；/n(e)与(a)-(d)任一序列的至少一部分互补的序列。/n

【技术特征摘要】
1.核酸分子在植物转基因、分子育种、病害防治和分子标记物中的用途，其特征在于，所述核酸分子具有选自下述(a)-(e)组成的组中的一种碱基序列：
(a)SEQIDNo.:1-35所示的序列；
(b)在(a)中碱基序列的基础上经宿主密码子偏好性改造的序列；
(c)(a)中所示序列的保守区序列；
(d)与(a)-(c)的序列同一性为95％以上且来源于相同属的序列；
(e)与(a)-(d)任一序列的至少一部分互补的序列。


2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述核酸分子能够编码具有去环氧催化活性的蛋白酶。


3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述核酸分子来源于长穗偃麦草属或香柱菌属。


4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述核酸分子包含至少一种选自以下的碱基序列：第436-470位之间的碱基序列、第430-476位之间的碱基序列和第808-846位之间的碱基序列。


5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述核酸分子为引物或探针，在严格条件下所述引物或探针与SEQIDNo.:1-35所示的序列中的至少一部分互补。


6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述植物为能够感染...

【专利技术属性】
技术研发人员：孔令让，王宏伟，孙思龙，葛文扬，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37