犬附红细胞体唾液酸糖蛋白内肽酶osgep基因的原核表达、纯化方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种犬附红细胞体唾液酸糖蛋白内肽酶osgep基因的原核表达、纯化方法，步骤如下：⑴设计扩增osgep基因的特异性引物；⑵PCR扩增获得osgep基因片段并纯化；⑶将osgep基因片段中三联密码子为TGA处点突变为TGG；⑷将突变后的osgep基因连接至原核表达载体，构建重组表达质粒；⑸重组表达载体的原核表达以及表达形式的检测；⑹纯化osgep重组蛋白。本发明专利技术方法将犬附红细胞体的唾液酸糖蛋白内肽酶osgep基因进行原核表达并纯化得到纯度高的osgep蛋白，此蛋白可用于制备多抗血清、单克隆抗体，也可作为抗原包被酶标板，从而为犬附红细胞体血清学检测方法的建立奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
犬附红细胞体唾液酸糖蛋白内肽酶osgep基因的原核表达、纯化方法和应用
本专利技术属于生物
，尤其是一种利用犬附红细胞体唾液酸糖蛋白内肽酶osgep基因的原核表达、纯化方法和应用。
技术介绍
犬附红细胞体(Eperythrozooncanis)是一类附着于犬红细胞表面，或者游离于血浆中的不可培养的病原微生物，其寄生所引起的主要临床症状为贫血、发热、以及黄疸。临床上犬附红细胞体病的诊断最常用的方法为直接镜检法，但由于附红细胞体的形态缺乏典型性，很难进行确诊。此外，利用犬附红细胞体的16SrRNA基因进行PCR检测是目前临床上检测此种疾病较为先进和准确的方法，但此法检测成本昂贵，对检测人员的技术要求较高，且需要特定的仪器，如PCR扩增仪、琼脂糖凝胶电泳系统等，因此在临床上使用有较大的局限性。众所周知，血清学检测方法具有成本低，操作简单快速，且适用于临床大规模检测等优点，而目前市面上尚无针对于犬附红细胞体病的血清学检测方法。通过检索，尚未发现与本专利技术专利申请相关的专利公开文献。
技术实现思路
本专利技术目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种利用犬附红细胞体唾液酸糖蛋白内肽酶osgep基因的原核表达、纯化方法和应用。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种犬附红细胞体唾液酸糖蛋白内肽酶osgep基因的原核表达、纯化方法，步骤如下：⑴设计扩增osgep基因的特异性引物；⑵PCR扩增获得osgep基因片段并纯化；⑶将osgep基因片段中三联密码子为TGA处点突变为TGG；⑷将突变后的osgep基因连接至原核表达载体，构建重组表达质粒；⑸重组表达载体的原核表达以及表达形式的检测；⑹纯化osgep重组蛋白。而且，所述步骤⑴中，根据唾液酸糖蛋白内肽酶osgep基因序列，设计扩增此基因的特异性引物，分别在上游和下游引物插入BamHⅠ、HindⅢ酶切位点；特异性引物序列为：Osgep-F：SEQNO.1，即5'-GGATCCGTGGGGAGTCTCATATTAGGAAT-3'(下划线为BamHⅠ酶切位点)；Osgep-R：SEQNO.2，即5'-AAGCTTCTAAATTAAAAAATAGGCGTAAT-3'(下划线为HindⅢ酶切位点)。而且，所述步骤⑵中PCR扩增反应条件为：95℃预变性10分钟；95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸60秒，35个循环；72℃过延伸10分钟；PCR扩增反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳检测；将扩增产物进行凝胶回收，所回收的DNA片段进行序列测定。而且，所述步骤⑷中原核表达载体为pET-32a。或者，所述步骤⑶中，因犬附红细胞体在分类上属于支原体，其三联密码子中的TGA编码色氨酸，但TGA在大肠杆菌中是终止密码子，为了让osgep基因在大肠杆菌表达系统中顺利表达，需将osgep基因中第240位三联密码子TGA突变为TGG，以适应后续的原核表达系统；具体方法为：设计碱基点突变引物，按照点突变试剂盒进行操作，最终将突变后的质粒送测，选出成功突变的osgep基因片段克隆质粒。而且，所述步骤⑷中，将成功突变的osgep基因片段克隆质粒及pET-32a空载体质粒分别用BamHⅠ、HindⅢ限制性内切酶进行双酶切，此后分别回收酶切后的osgep基因片段以及pET-32a空载体，取离心管加入osgep基因片段、pET-32a空载体片段、T4DNA连接酶和连接用buffer，osgep基因片段：pET-32a空载体片段：T4DNA连接酶：连接用buffer的体积比为6：2：1：1，16℃连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布氨苄青霉素LB平板后，37℃培养过夜；挑取平板上单个菌落，接种于5mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃震荡培养8h，提取质粒后进行双酶切鉴定。而且，所述步骤⑸中，重组表达载体的原核表达时的诱导表达条件为：37℃，摇床转速为180rpm，诱导剂IPTG的终浓度为0.1mM，诱导时间为4h；在重组蛋白表达形式的检测中，取诱导表达的菌液1.5mL于8000r/min离心2min收集菌体，用500μLPBS溶液或者ddH2O重悬菌体，再次离心集菌，反复洗涤菌体2-3次，以去除培养基残液；将每管500μL菌体溶液置于冰水混合物上用超声破碎仪进行破碎，15s/次，间隔30s，每管破碎8-10次，直至液体澄清具有透光性；将已破碎好的样品于4℃条件下12000r/min离心10min；取40μL上清溶液至1.5mLEP管中，加入50μL2×SDS上样缓冲液，以及10μLDTT溶液，涡旋混匀；将沉淀中加入40μL灭菌ddH2O，50μL2×SDS上样缓冲液，以及10μLDTT溶液，充分涡旋混匀；将所有样品在沸水中煮10min，之后立即转入冰上静置5min；处理之后的样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳检测蛋白表达形式。而且，所述步骤⑹中，收集诱导表达的重组表达蛋白菌体，将菌体沉淀中加入1/10体积的平衡缓冲液，重悬后进行破碎；破碎后的澄清液体于4℃条件下12000r/min离心10min，去除上清，将沉淀用包涵体平衡缓冲液室温作用2h，或4℃作用过夜，直至沉淀溶解；此后将所述溶液进行纯化，收集纯化后的蛋白；其中，所述平衡缓冲液为：8M咪唑，0.1MNaH2PO4，0.01MTris碱，溶剂为水，混匀后调节pH至8.0，用0.45μm的滤器过滤溶液，置于4℃备用。而且，所述步骤⑹中使用镍柱亲和层析法纯化osgep重组蛋白。如上所述的犬附红细胞体唾液酸糖蛋白内肽酶osgep基因的原核表达、纯化方法得到的osgep重组蛋白在免疫方面中的应用。如上所述的犬附红细胞体唾液酸糖蛋白内肽酶osgep基因的原核表达、纯化方法得到的osgep重组蛋白在犬附红细胞体的临床诊断和/或检测试剂盒的开发方面中的应用。本专利技术取得的优点和积极效果为：1、本专利技术方法将犬附红细胞体的唾液酸糖蛋白内肽酶osgep基因进行原核表达并纯化得到纯度高的osgep蛋白，此蛋白可用于制备多抗血清、单克隆抗体，也可作为抗原包被酶标板，从而为犬附红细胞体血清学检测方法的建立奠定基础。2、本专利技术应用PCR技术扩增获得了犬附红细胞体osgep基因序列，经过碱基点突变试验后，将其三联密码子为TGA处突变为TGG，此后将点突变成功的osgep基因连接至pET-32a表达载体中，构建重组表达质粒，将重组表达质粒于大肠杆菌原核表达系统中进行诱导表达，利用镍柱亲和层析法纯化重组蛋白，并最终获得了较高纯度的osgep重组蛋白。osgep重组蛋白的高效表达和纯化为进一步制备多抗血清或单克隆抗体，以及为建立犬附红细胞体血清学检测方法奠定了基础。3、本专利技术所要解决的是当前针对于犬附红细胞体病临床上尚无可用的血清学检测方法的实际问题，而提供一种犬附红细胞体osgep基因重组原核表达蛋白及其纯化方法。本专利技术将犬附红细胞体osgep蛋白基因进行本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种犬附红细胞体唾液酸糖蛋白内肽酶osgep基因的原核表达、纯化方法，其特征在于：步骤如下：/n⑴设计扩增osgep基因的特异性引物；/n⑵PCR扩增获得osgep基因片段并纯化；/n⑶将osgep基因片段中三联密码子为TGA处点突变为TGG；/n⑷将突变后的osgep基因连接至原核表达载体，构建重组表达质粒；/n⑸重组表达载体的原核表达以及表达形式的检测；/n⑹纯化osgep重组蛋白。/n

【技术特征摘要】
1.一种犬附红细胞体唾液酸糖蛋白内肽酶osgep基因的原核表达、纯化方法，其特征在于：步骤如下：
⑴设计扩增osgep基因的特异性引物；
⑵PCR扩增获得osgep基因片段并纯化；
⑶将osgep基因片段中三联密码子为TGA处点突变为TGG；
⑷将突变后的osgep基因连接至原核表达载体，构建重组表达质粒；
⑸重组表达载体的原核表达以及表达形式的检测；
⑹纯化osgep重组蛋白。


2.根据权利要求1所述的犬附红细胞体唾液酸糖蛋白内肽酶osgep基因的原核表达、纯化方法，其特征在于：所述步骤⑴中，根据唾液酸糖蛋白内肽酶osgep基因序列，设计扩增此基因的特异性引物，分别在上游和下游引物插入BamHⅠ、HindⅢ酶切位点；特异性引物序列为：
Osgep-F：SEQNO.1；
Osgep-R：SEQNO.2。


3.根据权利要求1所述的犬附红细胞体唾液酸糖蛋白内肽酶osgep基因的原核表达、纯化方法，其特征在于：所述步骤⑵中PCR扩增反应条件为：95℃预变性10分钟；95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸60秒，35个循环；72℃过延伸10分钟；
PCR扩增反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳检测；将扩增产物进行凝胶回收，所回收的DNA片段进行序列测定。


4.根据权利要求1所述的犬附红细胞体唾液酸糖蛋白内肽酶osgep基因的原核表达、纯化方法，其特征在于：所述步骤⑷中原核表达载体为pET-32a。
或者，所述步骤⑶中，因犬附红细胞体在分类上属于支原体，其三联密码子中的TGA编码色氨酸，但TGA在大肠杆菌中是终止密码子，为了让osgep基因在大肠杆菌表达系统中顺利表达，需将osgep基因中第240位三联密码子TGA突变为TGG，以适应后续的原核表达系统；
具体方法为：设计碱基点突变引物，按照点突变试剂盒进行操作，最终将突变后的质粒送测，选出成功突变的osgep基因片段克隆质粒。


5.根据权利要求1所述的犬附红细胞体唾液酸糖蛋白内肽酶osgep基因的原核表达、纯化方法，其特征在于：所述步骤⑷中，将成功突变的osgep基因片段克隆质粒及pET-32a空载体质粒分别用BamHⅠ、HindⅢ限制性内切酶进行双酶切，此后分别回收酶切后的osgep基因片段以及pET-32a空载体，取离心管加入osgep基因片段、pET-32a空载体片段、T4DNA连接酶和连接用buffer，osgep基因片段：pET-32a空载体片段：T4DNA连接酶：连接用buffer的体积比为6：2：1：1，16℃连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌DH5α...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋淇淇，姜阜杉，杨琳燕，秦顺义，赵瑞利，
申请(专利权)人：天津农学院，
类型：发明
国别省市：天津;12