一种脐血单个核细胞的分离方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种脐血单个核细胞的分离方法及其应用，属于细胞分离技术领域。本发明专利技术方法只需将脐带血与Ficoll试剂混合，静置处理，得到分层液，再吸取中间白膜层的细胞，洗涤，所得沉淀中即包含所述的脐带血单个核细胞。本发明专利技术方法采用静置的方式，易于操作，花费时间短，且避免了离心对细胞造成的损伤，保证了细胞的存活率。本发明专利技术方法不需要对血液进行稀释处理，耗时更短。本发明专利技术方法降低了对实验人员的技术要求，可获得更稳定的分离效果。

【技术实现步骤摘要】
一种脐血单个核细胞的分离方法及其应用
本专利技术属于细胞分离
，具体涉及一种脐血单个核细胞的分离方法及其应用。
技术介绍
白细胞(WBC)是一类无色、球形、有核的血细胞。正常成人白细胞总数为(4.0～10.0)×109/L，可因每日不同时间和机体不同的功能状态而在一定范围内变化。白细胞不是一个均一的细胞群，根据其形态、功能和来源部位可以分为三大类：粒细胞、单核细胞和淋巴细胞，其中单核细胞和淋巴细胞属于单个核细胞(PBMC)。单个核细胞主要的分离方法是聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-hypaque)密度梯度离心法。聚蔗糖-泛影葡胺是一种较为理想的细胞分层液。其主要成分聚蔗糖是一种合成的蔗糖聚合物，分子量为40kD，具有高密度、低渗透压、无毒性的特点。高浓度的聚蔗糖溶液粘性高，易使细胞聚集，故通常使用60g/L的低浓度溶液，密度为1.020，添加比重为1.200的泛影葡胺以增加密度。该方法应用非常广泛，单个核细胞得率可达80％～90％。但是，该方法在操作时需将血液稀释，必须将稀释后的血液缓慢加入装有分层液的离心管中，离心处理后，离心管中会出现几个不同层次的液体和细胞带。其中，单个核细胞密集在血浆层和分层液的界面中，吸取该层细胞，洗涤，重悬，得到单个核细胞。该方法在加入血液时，除了要稀释处理，还必须谨慎操作，使血液和分层液形成一个清晰的界面，才不会影响单个核细胞的回收率，操作比较复杂、对技术要求高。因此，亟需建立一种工艺简单、便于操作的单个核细胞的分离方法。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的首要目的在于提供一种脐血单个核细胞的分离方法。本专利技术的另一目的在于提供上述脐带血单个核细胞的分离方法的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种脐血单个核细胞的分离方法，包括如下步骤：(1)将脐血与Ficoll试剂混合，静置处理30～50分钟，使液体分层；(2)吸取中间白膜层的细胞，离心洗涤，所得沉淀中即包含所述的脐血单个核细胞。步骤(1)中所述的脐血和Ficoll试剂的配比优选为体积比1:1～2；更优选为1:1。步骤(1)中所述的脐血和Ficoll试剂的总用量优选为20～80mL；更优选为40～60mL。步骤(1)中所述的静置处理的时间优选为30～40分钟。步骤(2)中所述的离心洗涤的条件优选为500～1000g、5～10分钟；更优选为800g、10分钟。步骤(2)中所述的离心洗涤的次数优选为2～3次。步骤(2)中所述的离心洗涤优选为使用生理盐水洗涤。上述脐血单个核细胞的分离方法在制备单个核细胞中的应用。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：1)本专利技术方法采用静置的方式，易于操作，花费时间短，且避免了离心对细胞造成的损伤，保证了细胞的存活率。2)本专利技术方法不需要对血液进行稀释处理，耗时更短。3)本专利技术方法降低了对实验人员的技术要求，可获得更稳定的分离效果。附图说明图1为各实施例和对比例的单个核细胞回收率、红细胞去除率和细胞活率比较结果图。具体实施方式下面结合实施例及附图对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。本专利技术实施例中所用脐带血均取自广东省。本专利技术实施例中所用Ficoll试剂为2份浓度为6％、密度为1.020g/L聚蔗糖与1份浓度为34％、密度为1.200g/L泛影葡胺水溶液混合得到。实施例11.将20mLFicoll加入50mL离心管中(记为管①)。2.将20mL脐带血加入50mL离心管(记为管②)中，摇匀，进行细胞计数，全血单个核细胞为13.1×109个/L，全血红细胞为3.42×1012个/L。3.用移液管将管②中的脐带血直接注入装有Ficoll的管①中，颠倒混匀，静置处理。4.静置40分钟后，可以看到管内分为3层，上层为血浆，下层为红细胞和粒细胞，中间层是以单个核细胞为主的白膜层。5.用移液器吸取白膜层，将白膜层移入一个50mL离心管中(记为管③)，用生理盐水洗2遍，每次离心800g、8分钟。6.最后用10ml生理盐水重悬细胞，混匀，进行细胞计数，分离后的单个核细胞为19.9×109个/L，分离后的红细胞为0.075×1012个/L。实施例21.将30mLFicoll加入50mL离心管中(记为管①)。2.将20mL脐带血加入50mL离心管(记为管②)中，摇匀，进行细胞计数，全血单个核细胞为7.5×109个/L，全血红细胞为3.18×1012个/L。3.用移液管将管②中的脐带血直接注入装有Ficoll的管①中，颠倒混匀，静置处理。4.静置40分钟后，可以看到管内分为3层，上层为血浆，下层为红细胞和粒细胞，中间层是以单个核细胞为主的白膜层。5.用移液器吸取白膜层，将白膜层移入一个50mL离心管中(记为管③)，用生理盐水洗2遍，每次离心800g、8分钟。6.最后用10ml生理盐水重悬细胞，混匀，进行细胞计数，分离后的单个核细胞为10.6×109个/L，分离后的红细胞为0.12×1012个/L。实施例31.将40mLFicoll加入250mL离心管中(记为管①)。2.将20mL脐带血加入250mL离心管(记为管②)中，摇匀，进行细胞计数，全血单个核细胞为9.8×109个/L，全血红细胞为3.16×1012个/L。3.用移液管将管②中的脐带血直接注入装有Ficoll的管①中，颠倒混匀，静置处理。4.静置40分钟后，可以看到管内分为3层，上层为血浆，下层为红细胞和粒细胞，中间层是以单个核细胞为主的白膜层。5.用移液器吸取白膜层，将白膜层移入一个50mL离心管中(记为管③)，用生理盐水洗2遍，每次离心800g、8分钟。6.最后用10ml生理盐水重悬细胞，混匀，进行细胞计数，分离后的单个核细胞为13.4×109个/L，分离后的红细胞为0.19×1012个/L。实施例41.将20mLFicoll加入50mL离心管中(记为管①)。2.将20mL脐带血加入50mL离心管(记为管②)中，摇匀，进行细胞计数，全血单个核细胞为11.3×109个/L，全血红细胞为3.46×1012个/L。3.用移液管将管②中的脐带血直接注入装有Ficoll的管①中，颠倒混匀，静置处理。4.静置30分钟后，可以看到管内分为3层，上层为血浆，下层为红细胞和粒细胞，中间层是以单个核细胞为主的白膜层。5.用移液器吸取白膜层，将白膜层移入一个50mL离心管中(记为管③)，用生理盐水洗2遍，每次离心800g、8分钟。6.最后用10ml生理盐水重悬细胞，混匀，进行细胞计数，分离后的单个核细胞为12.8×109个/L，分离后的红细胞为0.02×1012个/L。实施例51.将本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种脐血单个核细胞的分离方法，其特征在于：包括如下步骤：/n(1)将脐血与Ficoll试剂混合，静置处理30～50分钟，使液体分层；/n(2)吸取中间白膜层的细胞，离心洗涤，所得沉淀中即包含所述的脐带血单个核细胞。/n

【技术特征摘要】
1.一种脐血单个核细胞的分离方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)将脐血与Ficoll试剂混合，静置处理30～50分钟，使液体分层；
(2)吸取中间白膜层的细胞，离心洗涤，所得沉淀中即包含所述的脐带血单个核细胞。


2.根据权利要求1所述的脐血单个核细胞的分离方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的脐血和Ficoll试剂的配比为体积比1:1～2。


3.根据权利要求1所述的脐血单个核细胞的分离方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的脐血和Ficoll试剂的总用量为20～80mL。


4.根据权利要求3所述的脐血单个核细胞的分离方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的脐血和Ficoll试剂的总用量为40～60mL。


5.根据权利要求1所述的脐血单个核细胞的分...

【专利技术属性】
技术研发人员：嵐山芮，魏伟，徐佳，
申请(专利权)人：广州市天河诺亚生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44