一种用于流式细胞仪分析的淋巴细胞样品的制备方法技术

本发明专利技术涉及医药领域，提供一种流式细胞仪的淋巴细胞样品的制备方法，其包括:取抗凝血液样品离心，得血细胞沉淀，用PBS溶液稀释，然后加入到含有淋巴细胞分离液的离心管中离心，弃掉血浆，得白膜层细胞；然后加入到离心管中，添加PBS溶液，离心弃上清液，再加入PBS溶液调节细胞浓度，将细胞溶液加入流式管内；然后加入抗体充分混均，避光孵育；离心并弃掉上清液，加入预冷的PBS‑EDTA溶液重悬细胞，即得。本发明专利技术方法得到的样品富集纯化了淋巴细胞，充分保存了淋巴细胞的活性，尽可能去除粒细胞、红细胞、血小板等其它血液成分，使需要检测的亚群分群明显纯化，分析检测更加准确，节省了分析抗体和试剂成本。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】一种用于流式细胞仪分析的淋巴细胞样品的制备方法
本专利技术涉及医药领域，具体涉及一种淋巴细胞样品的制备方法，特别是涉及一种用于流式细胞仪分析的免疫细胞中淋巴细胞样品的制备方法。
技术介绍
流式细胞样品主要用于血液样品检测中，而常规的流式细胞仪检测细胞样品的制备通常采用如下方法：(1)外周血不同处理方式对流式细胞仪检测结果影响分析；(2)流式细胞术检测25例肺癌患者T淋巴细胞亚群表型分析；取流式管，加入相应体积的抗体，然后加入抗凝外周血样品50或100μl，混匀，室温避光孵育20分钟，分别加入1×溶血素(即红细胞裂解液)，混匀后再用于上机检测。目前的流式细胞样本制备方法多是通过抗凝外周血与抗体孵育20-30分钟，加入红细胞裂解液进行裂解5-15分钟，然后直接上机检测，或者洗涤一次再上机检测。这样的制备方法，有如下问题，一、加入红细胞裂解液控制时间问题。根据红细胞的多少，加入足量的溶血素，加入溶血素后要观察是否清亮，如果清亮就说明红细胞裂解完全，但是容易造成淋巴细胞损伤，如果裂解时间不足，红细胞裂解不完全，影响检测分析。二、不能严格控制淋巴细胞样本量，无论原血中的淋巴细胞多与少，都加入一样体积的抗体，容易造成抗体过饱和或不足，细胞检测样本量少时，微量的细胞亚型很难被检测到或因样本量少而不准确，不能够准确反映某些淋巴细胞亚群的实际情况。细胞样本量多时，如患病的某些人群淋巴细胞超标，抗体的量就会不足，导致检测结果偏低；三、裂解得到样品碎片多，背景不干净，影响流式细胞仪数据的收集和分析，对淋巴细胞补偿调整可能引起偏倚现象。CN201410486089.7公开了一种淋巴细胞免疫分型的方法和试剂盒，其方法包括：取两根流式管，加入混合抗体到相应流式管中，加入50μl抗凝外周血样品，充分混均，室温避光孵育30分钟，然后，用红细胞裂解液裂解红细胞，5分钟，加入1mlPBS洗涤一次后(3500rpm，2min)，加入200μlPBS，流式细胞仪上机检测，该专利技术同样存在上述技术问题。因此，有必要开发新的用于流式细胞仪分析的淋巴细胞样品的制备方法。
技术实现思路
针对以上技术现状，本专利技术提供一种流式细胞样品的制备方法，所述方法包括：1)取离体抗凝血液样品进行离心，分离血浆和血液沉淀，得血液细胞沉淀；2)将血液细胞沉淀与PBS溶液混合，得血液细胞稀释液；3)取一支离心管，加入步骤2)中终体积等量的淋巴细胞分离液。将血液细胞稀释液加入到淋巴细胞分离液的离心管中，去除血浆，取白膜层细胞；4)添加白膜层细胞到离心管中，添加PBS溶液混匀、离心、弃上清液，再加入PBS溶液调整细胞浓度，得1×105个/ml～1×108个/ml，优选1.5×106个/ml～3×106个/ml，最佳为1.5～2.0×106个/ml的淋巴细胞悬液；作为示例性的说明，可以为1.5×106个/ml、1.6×106个/ml、1.7×106个/ml、1.8×106个/ml、1.9×106个/ml、或2.0×106个/ml的浓度；5)将淋巴细胞悬液分别加入流式管内，然后加入用于标记淋巴细胞亚群的流式抗体，混匀，静置于2～8℃避光孵育；6)加入PBS溶液混匀，离心去除未结合的抗体；7)样本的完成①如果立即上机检测，弃去上清，用2～8℃的PBS-EDTA溶液，混匀，用于流式检测；②如不能立即检测，加入0.05-5％的福尔马林、优选1％的福尔马林，混匀，静置于2～8℃避光保存；检测前各管加入PBS溶液离心弃掉上清液；用2～8℃的PBS-EDTA溶液，混匀，用于流式检测；本专利技术方法中，作为实施方案之一，所述PBS溶液为pH7.2～7.4的0.005-0.05MPBS溶液；本专利技术方法中，作为示例的说明，所述0.005-0.05MPBS溶液可以为0.005MPBS、0.01MPBS、0.02MPBS、0.03MPBS、0.04MPBS或0.05MPBS溶液作为实施方案之一，可选择地，PBS缓冲溶液中可以含有小牛血清和/或EDTA，所述小牛血清或EDTA的浓度可是本领域常规的浓度。本专利技术方法中，作为实施方案之一，所述PBS-EDTA溶液为pH7.2～7.4的含有0.005-0.05MPBS和终浓度为2-3mMEDTA的混合溶液。本专利技术方法中，作为实施方案之一，本专利技术所述步骤1)进一步包括离心条件：1500～3500rpm、5～30min；优选为1500-2900rpm、15-20min。本专利技术方法中，作为实施方案之一，所述步骤2)中血液细胞沉淀与PBS溶液的按1:0.5～1:2、优选1:1的体积比例加入。本专利技术方法中，作为实施方案之一，本专利技术所述步骤3)进一步包括离心条件为1500-3500rpm，10-20min，4℃；优选1500-2900rpm，20min，4℃。本专利技术方法中，作为实施方案之一，本专利技术所述步骤4)进一步包括离心为条件为1500-3500rpm离心5-20分钟；优选1500-2900rpm下离心5-10分钟。本专利技术方法中，作为实施方案之一，本专利技术所述步骤6)进一步包括离心为条件为1500-2900rpm下离心5-10分钟。本专利技术方法中，作为实施方案之一，所述步骤6)中加入PBS溶液的量为血液细胞沉淀的等体积的量。本专利技术方法中，作为实施方案之一，所述步骤7)中的PBS溶液为pH7.2～7.4的0.005-0.05MPBS溶液；作为实施方案之一，可选择地，PBS缓冲溶液中可以含有小牛血清和/或EDTA，所述小牛血清或EDTA的浓度可是本领域常规的浓度；作为实施方案之一，所述PBS-EDTA溶液为pH7.2～7.4的含有0.005-0.05MPBS和终浓度为2-3mMEDTA的混合溶液。本专利技术方法中，作为实施方案之一，所述淋巴细胞包括但不限于淋巴细胞亚群，可以包括记忆性淋巴细胞和其它需要检测的淋巴细胞亚群，以及针对淋巴细胞亚群的功能性分析和细胞因子分析、树突细胞成熟度检测等。作为实施方案之一，本专利技术所述方法包括(一)外周血中分离人外周血单核细胞(1)取离体抗凝外周血液样品(2)将血液样品加入到离心管中离心；弃掉上层血浆，得下层血液细胞沉淀；(3)将血液细胞沉淀与PBS溶液按1:1体积比进行稀释，得血液细胞稀释液。(4)取离心管，加入与血液细胞稀释液等体积的淋巴细胞分离液。(5)将血液细胞稀释液缓慢加入到步骤(4)的离心管中，保持分离液分层清晰。(6)缓慢放入低速离心机内，配平后离心。(7)离心结束后弃掉上清，得白膜层细胞。(8)取白膜层细胞至离心管内，并添加PBS溶液，计数后、离心。(9)离心后，去除上清液。根据计数结果计算加入2～8℃的PBS溶液，使细胞密度在1.5-3.0×106个/ml，即得淋巴细胞悬液；作为示例性说明，1.5×10<本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种供流式细胞仪分析的免疫细胞中的淋巴细胞样品的制备方法，其特征在于，所述方法包括：/n1)取离体抗凝血液样品离心，分离血浆和血液细胞沉淀，得血液细胞沉淀；/n2)将血液细胞沉淀与PBS溶液进行混合，得血液细胞稀释液；/n3)将血液细胞稀释液加入到含等体积量的淋巴细胞分离液的离心管中离心，去除血浆，得白膜层细胞；/n4)将白膜层细胞加入到离心管中，然后添加PBS溶液混匀，离心，弃上清液，然后加入PBS溶液调整细胞浓度，得1×10

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】一种供流式细胞仪分析的免疫细胞中的淋巴细胞样品的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
1)取离体抗凝血液样品离心，分离血浆和血液细胞沉淀，得血液细胞沉淀；
2)将血液细胞沉淀与PBS溶液进行混合，得血液细胞稀释液；
3)将血液细胞稀释液加入到含等体积量的淋巴细胞分离液的离心管中离心，去除血浆，得白膜层细胞；
4)将白膜层细胞加入到离心管中，然后添加PBS溶液混匀，离心，弃上清液，然后加入PBS溶液调整细胞浓度，得1×10
5个/ml～1×10
8个/ml浓度的淋巴细胞悬液；优选浓度1.5×10
6个/ml～5×10
6个/ml，进一步优选浓度1.5～3.0×10
6个/ml；

5)取淋巴细胞悬液加入流式管内；并加入用于标记淋巴细胞亚群的流式抗体，混匀，静置并在2～8℃下避光孵育；
6)加入PBS溶液，混匀，离心并去除未结合抗体；
7)样本的完成
①如果立即上机检测，弃去上清，用2～8℃的PBS-EDTA溶液，混匀，用于流式检测；或
②如不能立即检测，加入福尔马林溶液，混匀，静置于2～8℃避光保存；检测前各管加入PBS溶液离心弃掉上清液；用2～8℃的PBS-EDTA溶液，混匀，用于流式检测。


根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PBS溶液为pH7.2～7.4的0.005-0.05MPBS溶液；所述PBS-EDTA溶液为pH7.2～7.4的含有0.005-0.05MPBS和终浓度为2-3mMEDTA的混合溶液。


根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)进一步包括离心条件为1500～3500rpm，5～30min；优选为1500-2900rpm，15-20min。


根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中血液细胞沉淀与PBS溶液按1:0.5～1:2，优选1:1的体积比例加入。


根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)进一步包括离心条件为1500-3500rpm，10-20min，4℃；优选1500-2900rpm，20min，4℃。


根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4)进一步包括离心条件为：1500-3500rpm离心5-20分钟；优选离心条件为1500-2900rp...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚伟丽，
申请(专利权)人：铭道创新北京医疗技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11