一种免疫细胞中淋巴细胞的流式细胞仪检测方法技术

提供一种免疫细胞中淋巴细胞的流式细胞仪检测方法，该方法包括：a)取免疫荧光抗体染色的淋巴细胞样品，加入预冷的PBS‑EDTA溶液，混均细胞，备流式细胞仪检测待用；b)对流式细胞仪系统进行开机预热，调节液流速度，然后向样品管中加入PBS‑EDTA溶液，冲洗液流的喷嘴系统；c)将步骤a)所得混均细胞样品加入样品管然后进行检测。该检测方法在检测时可使亚群分群明显，分析检测更加准确，有利于检测数量较少的细胞亚群，并节省抗体试剂。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】一种免疫细胞中淋巴细胞的流式细胞仪检测方法
本专利技术涉及医药领域，具体提供一种免疫细胞中的淋巴细胞流式细胞仪检测方法。
技术介绍
人体免疫系统通常分为：免疫器官和免疫组织、免疫细胞(吞噬细胞和淋巴细胞)、免疫活性物质(抗体、溶菌酶、补体、免疫球蛋白、干扰素、白细胞介素、肿瘤坏死因子等细胞因子)。其中传统的免疫淋巴细胞的检测通常是外周血100微升，加入荧光抗体，孵育15-30分钟，然后用溶血素进行裂解红细胞，洗涤后加入上机缓冲液，并用流式细胞仪进行检测。CN201680006060.1公开了一种免疫状态的检查方法以及检查装置，该方法可以免疫细胞进行分型：T、B、NK、NKT、T细胞再分为CD4+T细胞，CD8+T细胞。该专利技术存在以下技术不足：1、浪费抗体和试剂材料；2、没有定义固有免疫的DC细胞这个亚型；3、个别淋巴细胞亚群定义不全面，而没有系统的考虑淋巴免疫系统功能，进而亚群分型不够全面、不够平衡；4、染完免疫荧光抗体后运用红细胞裂解液进行裂解红细胞，导致背景不干净，碎片多，数据容易出现误差；5、对于数量较少的淋巴细胞亚群，该方法检测不出来或者检测结果不准确；6、该检测方法容易出现过度染色或染色不足的情况，导致数据不准确。CN201410486089.7一种淋巴细胞免疫分型的方法和试剂盒将T细胞更细的分为同样的分类T、B、NK、NKT，T细胞再分为CD4+T细胞，CD8+T细胞，在此基础上，运用CD45RA和CD27联合定义了几种T细胞，运用CD19、CD24、CD38、CD27，定义了4种B细胞。该专利技术存在以下技术不足：1、浪费抗体和试剂材料；2、没有定义固有免疫的DC细胞这个亚型；3、个别淋巴细胞亚群定义不全面，而没有系统的考虑淋巴免疫系统功能，进而亚群分型不够全面、不够平衡；4、染完免疫荧光抗体后运用红细胞裂解液进行裂解红细胞，导致背景不干净，碎片多，数据容易出现误差；5、对于数量较少的淋巴细胞亚群，该方法检测不出来或者检测结果不准确；6、该检测方法容易出现过度染色或染色不足的情况，导致数据不准确。因此、如何更全面的平衡的淋巴细胞亚群的检测方法依然是目前研究的热点，目前依然没有相关方面的报道。
技术实现思路
针对以上技术现状，本专利技术提供一种免疫细胞中淋巴细胞的检测方法，所述方法包括所述方法包括：a)取免疫荧光抗体染色的淋巴细胞样品，加入预冷的PBS-EDTA溶液，混均细胞，备流式细胞仪检测待用；b)对流式细胞仪系统进行开机预热，调节的流速度为10-29μl/min的低速范围或30～44μl/min的中速范围，然后向样品管中加入PBS-EDTA溶液，冲洗液流的喷嘴系统；c)将步骤a)所得混均细胞样品加入样品管然后进行检测。本专利技术方法中，作为实施方案之一，所述步骤a)中预冷的温度为本领域进行流式细胞仪检测时常用的温度，本专利技术包括但不限于2～8℃。本专利技术方法中，作为实施方案之一，所述步骤a)或步骤b)中的所述PBS-EDTA溶液为pH7.2～7.4的含有0.005-0.05MPBS和终浓度为2-3mMEDTA的混合溶液；本专利技术中，作为实施方案之一，所述0.005-0.05MPBS作为示例性的说明，可以为0.005MPBS、0.01MPBS、0.02MPBS、0.03MPBS、0.04MPBS或0.05MPBS。本专利技术方法中，作为实施方案之一，所述步骤a)中进一步包括：淋巴细胞样品中细胞的浓度为1×106～10×106个/ml；优选的浓度范围是1.5×106个/ml～5×106个/ml，进一步优选1.5～3.0×106个/ml。本专利技术方法中，作为实施方案之一，所述步骤a)中进一步包括：淋巴细胞样品的体积为适于检测的体积，本专利技术包括但不限于为50～200μl。本专利技术方法中，作为实施方案之一，所述步骤b)中调节液流速度为30-44μl/min的中速范围；作为进一步实施方案之一，所述调节液流速为35～40μl/min的中速范围，作为示例性的说明可以为35μl/min、36μl/min、37μl/min、38μl/min、39μl/min或40μl/min。本专利技术方法中，作为实施方案之一，所述步骤b)中预热时间可为适于检测的时间，可以由本领域技术人员进行调整，本专利技术优选为5～10分钟。本专利技术方法中，作为实施方案之一，所述步骤b)中加入样品管中的PBS-EDTA溶液的量可以由本领域技术人员根据检测设备和条件进行确定，例如包括但不限于3ml。本专利技术方法中，作为实施方案之一，所述步骤c)进一步包括设置条件为：门内3000～20000个细胞，优选门内15000个细胞，采集样品。本专利技术方法中，作为实施方案之一，所述流式淋巴细胞样品采用如下方法制备：1)取离体抗凝血液样品进行离心，分离血浆和血液细胞沉淀，得血液细胞沉淀；2)将血液细胞沉淀用PBS溶液进行稀释，得血液细胞稀释液；3)将血液细胞稀释液缓慢加入到含等体积的淋巴细胞分离液的离心管中，然后离心，去掉血浆，取中间白膜层细胞；4)取步骤3)所得白膜层细胞加入到离心管中，加入PBS溶液混合均匀得混悬液，离心并去除上清液，然后再加入PBS溶液，调整细胞浓度在1×105个/ml～1×108个/ml，优选的浓度范围是1.5×106个/ml～5×106个/ml，进一步优选1.5～3.0×106个/ml；作为示例性的说明，可以为1.5×106个/ml、2.0×106个/ml、2.5×106个/ml、3.0×106个/ml。5)取步骤4)所得调整浓度后的淋巴细胞加入流式管内；并加入用于标记淋巴细胞亚群的流式抗体，混匀，2～8℃静置并避光孵育；6)加入PBS溶液、混匀，离心洗掉未结合抗体；7)样品的完成①如果立即上机检测，则弃去上清，加入预冷至2～8℃的PBS-EDTA溶液，混匀细胞，用于流式检测；②如不能立即检测，不需PBS溶液稀释，直接用0.05-5％福尔马林500μl悬起细胞，混匀，静置于2～8℃避光保存；检测前各管加入PBS溶液，离心弃掉上清液，用2～8℃的PBS-EDTA溶液、混匀细胞，用于流式检测；本专利技术方法中，作为实施方案之一，所述PBS溶液为pH7.2～7.4的0.005～0.05MPBS溶液；作为实施方案之一，所述PBS缓冲溶液可以有小牛血清和/或EDTA，所述小牛血清或EDTA的浓度可以为本领域常用的浓度。本专利技术方法中，作为实施方案之一，所述PBS-EDTA溶液为pH7.2～7.4的含有0.005-0.05MPBS和终浓度为2-3mMEDTA的混合溶液。本专利技术方法中，作为实施方案之一，所述步骤1)进一步包括离心条件为1500～3500rpm离心5～30min；优选1500-2900rpm离心15-20分钟。本专利技术方法中，作为实施方案之一，所述步骤2)进一步包括血液细胞沉淀用本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种免疫细胞中淋巴细胞的检测方法，其特征在于，所述方法包括：/na)取免疫荧光抗体染色的淋巴细胞样品，加入预冷的PBS-EDTA溶液，混均细胞，备流式细胞仪检测待用；/nb)对流式细胞仪系统进行开机预热，调节液流速度为10-29μl/min的低速范围或30～44μl/min的中速范围，向样品管中加入PBS-EDTA溶液，冲洗液流的喷嘴系统；/nc)将步骤a)所得混均细胞样品加入样品管然后进行检测。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】一种免疫细胞中淋巴细胞的检测方法，其特征在于，所述方法包括：
a)取免疫荧光抗体染色的淋巴细胞样品，加入预冷的PBS-EDTA溶液，混均细胞，备流式细胞仪检测待用；
b)对流式细胞仪系统进行开机预热，调节液流速度为10-29μl/min的低速范围或30～44μl/min的中速范围，向样品管中加入PBS-EDTA溶液，冲洗液流的喷嘴系统；
c)将步骤a)所得混均细胞样品加入样品管然后进行检测。


根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PBS-EDTA溶液为pH7.2～7.4的含有0.005-0.05MPBS和终浓度为2-3mMEDTA的混合溶液。


根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤a)中进一步包括：淋巴细胞样品中细胞的浓度为1×10
6～10×10
6个/ml。



根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤a)中进一步包括：淋巴细胞样品的体积为50-200μl。


根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤b)中调节液流速为30～44μl/min的中速范围；优选35～40μl/min的中速范围。


根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤b)中进一步包括预热时间为5～10分钟。


根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤c)进一步包括设置条件为：门内3000～20000个细胞，优选门内15000个细胞；采集样品。


根据权利要求1～7任一所述的方法，其特征在于，所述流式淋巴细胞样品采用如下方法制备：
1)取离体抗凝血液样品进行离心，分离血浆和血液细胞沉淀，得血液细胞沉淀；
2)将血液细胞沉淀用PBS溶液进行稀释，得血液细胞稀释液；
3)将血液细胞稀释液缓慢加入到含等体积的淋巴细胞分离液的离心管中，然后离心，去掉血浆，取白膜层细胞；
4)取步骤3)所得白膜层细胞加入到离心管中，加入PBS溶液混合均匀，离心并去除上清液，然后再加入PBS溶液，调整细胞浓度在1×10
5个/ml～1×10
8个/ml，优选的浓度范围是1.5×10
6个/ml～5×10
6个/ml，进一步优选1.5～3.0×10
6个/ml；

5)取步骤4)所得调整浓度后的淋巴细胞加入流式管内；并加入用于标记淋巴细胞亚群的流式抗体，混匀，2～8℃静置并避光孵育；
6)加入PBS溶液、混匀，离心洗掉未结合抗体；
7)样品的完成
①如果立即上机检测，则弃去上清，加入预冷至2～8℃的PBS-EDTA溶液，混匀细胞，用于流式检测；
②如不能立即检测，直接用0.05-5％福尔马林悬起细胞，混匀，静置于2～8℃避光保存；检测前各管加入PBS溶液，离心弃掉上清液，用2～8℃的PBS-EDTA溶液、混匀细胞，用于流式检测。


根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述PBS溶液为pH7.2～7.4的0.005-0.05MPBS溶液；所述PBS-EDTA溶液为pH7.2～7.4的含有0.005-0.05MPBS和终浓度为2-3mMEDTA的混合溶液。


根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤1)进一步包括离心条件为1500～3500rpm离心5～30min；优选1500-2900rpm离心15-20分钟。


根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤2)进一步包括血液细胞沉淀用PBS溶液以1...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚伟丽，
申请(专利权)人：铭道创新北京医疗技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11