一种高温高压状态下的蛋白质快速水解分析方法技术

本发明专利技术公开了一种高温高压状态下的蛋白质快速水解分析方法。其中，该方法包括：(1)将蛋白质样品与酸混合配制酸性溶液，其中所述蛋白质样品中含有天冬氨酸；(2)于密闭环境中将所述酸性溶液加热至高温高压状态，以便使所述蛋白质样品水解；(3)采用高分辨质谱仪对步骤(2)得到的水解液进行质谱分析。方法不仅步骤简单、处理快速、引入杂质少且成本低廉，还可以通过鉴定蛋白质的特异性水解片段得到原始蛋白序列信息，该自下而上的蛋白质分析方法可以作为蛋白质特征肽段、以及指纹图谱分析的有力工具，从而特异性地鉴定目标蛋白。

【技术实现步骤摘要】
一种高温高压状态下的蛋白质快速水解分析方法
本专利技术属于蛋白质组学研究领域，具体而言，涉及蛋白质的自下而上的特征多肽碎片的检测方法，更具体地，涉及一种高温高压状态下的蛋白质快速水解分析方法。
技术介绍
使用蛋白酶对蛋白质进行特异性解离，检测新产生游离特征肽段的方法是最为常见的蛋白质分析手段之一。不同种类的蛋白酶作用的位点不尽相同，最常见的胰蛋白酶的作用位点是赖氨酸和精氨酸的C末端。传统酶解通常需要适宜的环境温度(约37℃)和较长的反应时间(大于10h)，且由于引入的反应体系复杂，杂质较多，需要使用液相色谱等方式进行分离纯化，或使用基质辅助激光解离技术进行质谱进样。近些年来，固定化蛋白酶技术、微波催化蛋白酶技术等新型酶切技术在一定程度上提升了蛋白质解离的效率，但仍然存在着装置重复性差，反应体系复杂、引入较多大分子有机物(如蛋白酶自溶片段)和小分子无机盐等杂质的劣势。
技术实现思路
本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本专利技术的一个目的在于提出一种高温高压状态下的蛋白质快速水解分析方法，该方法步骤简单、处理快速且引入杂质少，可以通过鉴定蛋白质的特异性水解片段得到原始蛋白序列信息，是一种新型的自下而上的蛋白质分析方法。根据本专利技术的第一个方面，本专利技术提出了一种高温高压状态下的蛋白质快速水解分析方法。根据本专利技术的实施例，该方法包括：(1)将蛋白质样品与酸混合配制酸性溶液，其中所述蛋白质样品中含有天冬氨酸；(2)于密闭环境中将所述酸性溶液加热至高温高压状态，以便使所述蛋白质样品水解；(3)采用高分辨质谱仪对步骤(2)得到的水解液进行质谱分析。专利技术人发现，在酸性环境下加热蛋白质，无需引入蛋白酶即可使其肽链上天冬氨酸的C-末端和N-末端位点发生断裂，由此不仅可以避免产生蛋白酶自溶物等大分子有机物，同时还可以避免引入蛋白酶制备过程中存在的无机盐等不利于质谱检测的非挥发性杂质；与常规酶解的固定化酶等技术相比，本专利技术无需对水解反应装置进行前处理，水解装置搭建简单且重复性好；此外，与常规酶解温度37℃和常规酶解时间12-24h相比，本专利技术中通过使蛋白质在高温高压状态下水解，酶解效率大幅度提升，显著地减少了时间的消耗。综上所述，本专利技术上述实施例的高温高压状态下的蛋白质快速水解分析方法不仅步骤简单、处理快速、引入杂质少且成本低廉，还可以通过鉴定蛋白质的特异性水解片段得到原始蛋白序列信息，具体地，该自下而上的蛋白质分析方法可以作为蛋白质特征肽段、以及指纹图谱分析的有力工具，从而特异性地鉴定目标蛋白。另外，根据本专利技术上述实施例的高温高压状态下的蛋白质快速水解分析方法还可以具有如下附加的技术特征：在本专利技术的一些实施例中，步骤(1)中，所述酸性溶液的pH值为1～5，优选2～3。在本专利技术的一些实施例中，所述蛋白质样品为重组人泛素蛋白、牛血清蛋白、重组结核抗原Esat-6蛋白、重组结核抗原Cfp-10蛋白、核糖核酸酶或辣根过氧化氢酶等。在本专利技术的一些实施例中，步骤(1)中，配制所述酸性溶液之前，预先将所述蛋白质样品与还原剂混合，以便切断所述蛋白质样品中的二硫键。在本专利技术的一些实施例中，步骤(2)中，所述加热时间不大于20min，优选1～4min。在本专利技术的一些实施例中，步骤(2)中，所述酸性溶液在高温高压状态下的温度为105～200℃，压力为1.2～16atm。在本专利技术的一些实施例中，步骤(2)中，所述酸性溶液在高温高压状态下的温度为150～200℃，压力为5～16atm。在本专利技术的一些实施例中，步骤(3)中，预先将步骤(2)得到的水解液与极性溶剂混合后再采用高分辨质谱仪进行分析。在本专利技术的一些实施例中，步骤(3)中，所述水解液中蛋白质的质量浓度为1～200ppm。在本专利技术的一些实施例中，步骤(3)中，所述质谱分析的进样方式为纳流电喷雾离子源。在本专利技术的一些实施例中，步骤(2)中，将所述酸性溶液置于微型密闭反应容器中进行加热，所述微型密闭反应容器为微型毛细管反应器或微型高压反应釜。在本专利技术的一些实施例中，所述微型毛细管反应器中，所述毛细管的材质为柔性毛细管或刚性毛细管。在本专利技术的一些实施例中，所述毛细管为细长型毛细管，所述毛细管的一端通过连接注射器或注射泵吸收所述酸性溶液，所述毛细管的两端通过加压方式进行密闭。在本专利技术的一些实施例中，所述毛细管的内径不大于4mm，长度不大于20cm；优选地，所述毛细管的内径不大于2mm，长度不大于10cm。在本专利技术的一些实施例中，所述毛细管为高分子聚合物毛细管，所述毛细管采用径向加压夹紧的方式进行密闭；或者，所述毛细管为不锈钢毛细管，所述毛细管采用轴向加压阻塞的方式进行密闭。在本专利技术的一些实施例中，所述加热采用接触式加热法或非接触式加热法；在本专利技术的一些实施例中，所述加热采用非接触式加热法，所述毛细管的外壁与发热单元之间填充有导热材料。根据本专利技术的第二个方面，本专利技术提出了一种用于上述高温高压状态下的蛋白质快速水解分析方法的微型毛细管反应器。根据本专利技术的实施例，该微型毛细管反应器包括：加热毛细管，所述加热毛细管进一步包括：毛细管；阀门，所述阀门包括第一阀门和所述第二阀门，所述第一阀门和所述第二阀门分别设在所述毛细管的两端，所述第一阀门和所述第二阀门控制所述毛细管的密闭状态；金属管，所述金属管套设在所述毛细管外且位于所述第一阀门和所述第二阀门之间，所述金属管的内表面与所述毛细管的外表面之间填充有导热材料；加热丝，所述加热丝缠绕在所述金属管外表面且所述加热丝表面包覆有绝缘层；热敏电阻，所述热敏电阻设在所述金属管的中部并通过所述绝缘层表面的小孔与所述金属管接触；加热控制器，所述加热控制器包括控制器和功率放大器，所述控制器通过所述功率放大器与所述加热毛细管相连。根据本专利技术上述实施例的微型毛细管反应器，对酸性溶液进行加热时，可以利用毛细管盛装酸性溶液、利用第一阀门和第二阀门对盛装酸性溶液后的毛细管进行密闭、利用加热丝通过金属管间接对毛细管内的酸性溶液进行加热、在金属管的内表面与毛细管的外表面之间填充导热材料来提高传热效率、利用热敏电阻反馈实时加热温度，且功率放大器通过接受控制器的信号控制电路的通道，实现对毛细管加热的启停。由此，可以快速使酸性溶液达到高温高压状态，以实现蛋白质的快速水解。在本专利技术的一些实施例中，所述毛细管为高分子聚合物毛细管，所述阀门包括螺丝和卡管，所述卡管具有与所述螺丝相匹配的螺纹，所述卡管套设在所述毛细管的两端且所述螺丝通过所述螺纹与所述卡管相连。本专利技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本专利技术的实践了解到。附图说明本专利技术的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：图1是根据本专利技术一个实施例的高温高压状态下的蛋白质快速水解分析方法的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高温高压状态下的蛋白质快速水解分析方法，其特征在于，包括：/n(1)将蛋白质样品与酸混合配制酸性溶液，其中所述蛋白质样品中含有天冬氨酸；/n(2)于密闭环境中将所述酸性溶液加热至高温高压状态，以便使所述蛋白质样品水解；/n(3)采用高分辨质谱仪对步骤(2)得到的水解液进行质谱分析。/n

【技术特征摘要】
1.一种高温高压状态下的蛋白质快速水解分析方法，其特征在于，包括：
(1)将蛋白质样品与酸混合配制酸性溶液，其中所述蛋白质样品中含有天冬氨酸；
(2)于密闭环境中将所述酸性溶液加热至高温高压状态，以便使所述蛋白质样品水解；
(3)采用高分辨质谱仪对步骤(2)得到的水解液进行质谱分析。


2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，步骤(1)中，所述酸性溶液的pH值为1～5，优选2～3；
任选地，所述蛋白质样品为重组人泛素蛋白、牛血清蛋白、重组结核抗原Esat-6蛋白、重组结核抗原Cfp-10蛋白、核糖核酸酶或辣根过氧化氢酶；
任选地，步骤(1)中，配制所述酸性溶液之前，预先将所述蛋白质样品与还原剂混合，以便切断所述蛋白质样品中的二硫键。


3.根据权利要求1或2所述的分析方法，其特征在于，步骤(2)中，所述加热时间不大于20min，优选1～4min；
任选地，步骤(2)中，所述酸性溶液在高温高压状态下的温度为105～200℃，压力为1.2～16atm；
任选地，步骤(2)中，所述酸性溶液在高温高压状态下的温度为150～200℃，压力为5～16atm。


4.根据权利要求3所述的分析方法，其特征在于，步骤(3)中，预先将步骤(2)得到的水解液与极性溶剂混合后再采用高分辨质谱仪进行分析；
任选地，步骤(3)中，所述水解液中蛋白质的质量浓度为1～200ppm；
任选地，步骤(3)中，所述质谱分析的进样方式为纳流电喷雾离子源。


5.根据权利要求1或4所述的分析方法，其特征在于，步骤(2)中，将所述酸性溶液置于微型密闭反应容器中进行加热，所述微型密闭反应容器为微型毛细管反应器或微型高压反应釜。


6.根据权利要求5所述的分析方法，其特征在于，所述微型毛细管反应器中，所述毛细管的材质为柔性毛细管或刚性毛细管；
任选地...

【专利技术属性】
技术研发人员：欧阳证，王宇晨，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：北京;11