一种纳米尺度单外泌体分离方法技术

本发明专利技术公开了一种纳米尺度单外泌体分离方法，将含有外泌体的细胞培养液充分稀释；加入超顺磁性氨基磁珠稀释液低频振荡混合，待纳米磁珠与外泌体发生偶联；将偶联液移至纳米孔阵列微芯片表层；将微芯片置于摇床上，进行低速小角度振荡，使偶联液均匀分布于芯片表层；在微芯片下表面放置磁源，使用渐进式磁力吸附方式，使磁珠外泌体偶联体进入纳米孔阵列；在更大磁力作用下，保持磁珠外泌体偶联体的稳定吸附，利用缓冲液清洗基片的上表面，静置后得到含有单外泌体的纳米微芯片，即可直接用于后续检测。本发明专利技术基于具有高精密筛作用的纳米孔微列微芯片，通过磁珠偶联外泌体、渐进磁力吸附，可实现高纯度单外泌体获取。

【技术实现步骤摘要】
一种纳米尺度单外泌体分离方法
本专利技术属于单外泌体分析
，具体涉及一种纳米尺度单外泌体分离方法。
技术介绍
外泌体(Exosome)是指由(绝大多数)细胞向外分泌的直径约为30～150nm的生物活性囊泡。外泌体具有典型的脂质双分子层膜结构，携带了分泌母细胞的多种蛋白质、脂类、核酸等重要信息，是细胞之间信息交流的重要载体和关键信使，在生物分子的转移以及各种疾病的生理和病理过程中具有重要作用。当前，外泌体的分离技术主要包括超速离心法、超滤离心法、微流道法、磁珠免疫法等。超速离心法是最常用的外泌体纯化手段，通过高速离心将不同尺寸的囊泡颗粒从可溶性分子中沉淀并纯化出来，但重复离心操作很可能对外泌体的囊泡造成损害从而降低其质量。超滤离心法是利用相对分子质量的差异对样品进行选择性分离，该方法简单高效，且不影响外泌体的生物活性，但是过滤孔易阻塞，导致膜的寿命减短，分离效率较低。微流道法基于粘弹性流动、纳米线陷阱等的原理，通过声学、电学和电磁学操控实现了不同尺度外泌体的有效分离，该方法具消耗极少、分离度高、成本低等优势，但微流道直径通常在微米级以上，难以实现纳米尺度单外泌体的分离。磁珠免疫法是一种免疫亲和技术，外泌体的蛋白质表面具有特异性受体，通过带有对应修饰物抗体的纳米颗粒从样本中捕获不同类型的外泌体，从而实现外泌体进行选择性分离，该方法具有高特异性、可获得高纯度的外泌体等优点，但是缺乏适当的载体承载分离得到独立的单外泌体，导致分离得到单外泌体的效率和分散度并不高。CN109576210A所公布的快速分离外泌体的方法，该方法通过在超顺磁性纳米颗粒和配体之间构建柔性结构单元，有效提高了从血清中分离外泌体的效率，但是该方法所得超顺磁纳米颗粒-聚乙二醇-配体复合物为高纯度团簇，需要后续进一步分散和处理才可获得单一独立外泌体。CN109266599A所公布的一种高效形貌无损的外泌体分离方法，该方法利用修饰有核酸适配体的磁珠识别并捕获外泌体样本，重点在于利用核酸适配体的互补链替换释放外泌体，但是该方法在磁珠和外泌体样本共孵育过后仍采用静置提取沉淀来获得磁珠-外泌体复合物，分散效率低，无法直接用于后续检测。目前，纳米尺度单外泌体的分离和检测面临着挑战和瓶颈，亟须开发单外泌体的精准分离方法，特别的，在通过磁珠免疫法实现外泌体的特异性分离和精准捕获的基础上，缺乏适当的载体承载分离得到独立的单外泌体，导致分离得到单外泌体的效率并不高，若将磁珠免疫法与微纳分离筛选芯片相结合，可以为提升分离效率并获得稳定分布的纳米尺度单外泌体提供可行方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种纳米尺度单外泌体分离方法，用于高纯度单外泌体获取，具有高产出、低耗时、低成本和易操作的特点，分离完成的含有单外泌体的纳米孔阵列微芯片可直接用于下一步检测，为突破纳米尺度单外泌体分离及测序前的瓶颈提供可行方法。本专利技术采用以下技术方案：一种纳米尺度单外泌体分离方法，包括以下步骤：S1、将经过生物提取的含有外泌体的细胞培养液充分稀释得到待分离外泌体样液；S2、向步骤S1制备的待分离外泌体样液中加入超顺磁性氨基磁珠稀释液，采用低频振动混合方式使纳米磁珠与外泌体充分偶联制得偶联液；S3、将步骤S2制得的偶联液移至纳米孔阵列微芯片表层；S4、将步骤S3的微芯片置于摇床上进行振荡，使偶联液均匀分布于纳米孔阵列微芯片表层；S5、在纳米孔阵列微芯片的下表面放置磁源，使用渐进式磁力吸附方式使磁珠外泌体偶联体进入纳米孔阵列；S6、保持磁珠外泌体偶联体稳定吸附，利用PBS缓冲液清洗基片的上表面，静置后得到含有单外泌体的纳米微芯片。具体的，步骤S1中，将含有外泌体的细胞培养液稀释至NTA定量测试外泌体浓度为1×107～1×109个/ml。具体的，步骤S2中，超顺磁性氨基纳米磁珠的直径为50～150nm，纳米磁珠稀释液的浓度为1×107～1×1010个/ml，超顺磁性氨基纳米磁珠与待分离外泌体的混合粒子数之比为(5～20)：1。具体的，超顺磁性氨基纳米磁珠与外泌体低频振动混合频率为20～50Hz，混合时间为3～5min。具体的，步骤S3中，纳米孔阵列微芯片一面的中心区域为纳米孔微阵列结构，偶联液的滴加速度为每秒2～3滴，滴加区域为纳米孔阵列的中心位置。具体的，纳米孔微阵列结构中纳米孔直径为所使用的纳米磁珠特征尺寸的1～2倍，纳米孔深度为纳米孔直径的1.5～2倍；纳米孔等间距分布形成方形或圆形微阵列，间距为纳米孔直径的5～10倍，单片纳米孔数量在数十万至百万量级。具体的，步骤S4中，摇床振荡设置摇摆速度为30～50rpm，摇摆周期为5～10°，摇摆振荡时间视外泌体浓度范围振荡3～5min。具体的，步骤S5中，渐进磁力吸附要求磁源按等距步进方式接近纳米孔阵列微芯片，磁源与微芯片初始距离为30～36mm，步进距离5～6mm，在每一个距离位置，将磁源平行于基片方向往复移动15～20mm一次并旋转540°，吸附磁珠的外泌体偶联粒子将在磁力作用下移动至外泌体的纳米孔位并发生陷落吸附，偶联粒子进入纳米孔内。进一步的，选用牌号N38～N42的钕铁硼方块磁铁或同等强度电磁铁作为磁源。具体的，步骤S6中，在磁源距离纳米孔阵列微芯片5～6mm处停止步进，利用PBS缓冲液清洗基片的上表面至少两次，静置8～10min后得到含有单外泌体的纳米微芯片。与现有技术相比，本专利技术至少具有以下有益效果：本专利技术一种纳米尺度单外泌体分离方法，充分发挥纳米级微阵列芯片的高精密筛选作用，通过单外泌体磁珠偶联、渐进磁力吸附的方法实现单外泌体在分离芯片孔位中的吸附分布，在纳米尺度分离得到单个外泌体，方法便捷且分离产量高，所需材料和工具易于获取。进一步的，将经过生物提取纯化后含有外泌体的细胞培养液稀释至NTA定量测试外泌体浓度范围为1×107～1×109个/ml，其分散度有利于步骤S2中纳米磁珠与外泌体发生偶联。进一步的，将磁珠样液稀释至浓度约为1×107～1×1010个/ml，超顺磁性氨基纳米磁珠与待分离外泌体混合比例为5～20:1，将使步骤S2中纳米磁珠对单个外泌体的捕获概率最大化。进一步的，直径为50～150nm的氨基纳米磁珠为医学分析常用材料，经过修饰且易于获取，是待分离外分泌直径(约为30～150nm)的1-1.5倍，利于提高步骤S2中纳米磁珠与外泌体的偶联概率。进一步的，采用频率为20～50Hz的低频振动混合方法混合3～5min，进一步提升步骤S2中超顺磁性氨基纳米磁珠与外泌体接触和偶联概率，且不易破坏已发生偶联的偶联体。进一步的，纳米孔阵列微芯片的通用盖玻片为基底材料，分离得到单外泌体后可直接进行显微检测。进一步的，纳米孔微阵列结构中纳米孔直径为所使用的纳米磁珠特征尺寸的1～2倍，纳米孔深度为纳米孔直径的1.5～2倍，保证纳米磁珠在捕获外泌体后在磁力作用下对能够落入纳米孔内，且仅允许单本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种纳米尺度单外泌体分离方法，其特征在于，包括以下步骤：/nS1、将经过生物提取的含有外泌体的细胞培养液充分稀释得到待分离外泌体样液；/nS2、向步骤S1制备的待分离外泌体样液中加入超顺磁性氨基磁珠稀释液，采用低频振动混合方式使纳米磁珠与外泌体充分偶联制得偶联液；/nS3、将步骤S2制得的偶联液移至纳米孔阵列微芯片表层；/nS4、将步骤S3的微芯片置于摇床上进行振荡，使偶联液均匀分布于纳米孔阵列微芯片表层；/nS5、在纳米孔阵列微芯片的下表面放置磁源，使用渐进式磁力吸附方式使磁珠外泌体偶联体进入纳米孔阵列；/nS6、保持磁珠外泌体偶联体稳定吸附，利用PBS缓冲液清洗基片的上表面，静置后得到含有单外泌体的纳米微芯片。/n

【技术特征摘要】
1.一种纳米尺度单外泌体分离方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将经过生物提取的含有外泌体的细胞培养液充分稀释得到待分离外泌体样液；
S2、向步骤S1制备的待分离外泌体样液中加入超顺磁性氨基磁珠稀释液，采用低频振动混合方式使纳米磁珠与外泌体充分偶联制得偶联液；
S3、将步骤S2制得的偶联液移至纳米孔阵列微芯片表层；
S4、将步骤S3的微芯片置于摇床上进行振荡，使偶联液均匀分布于纳米孔阵列微芯片表层；
S5、在纳米孔阵列微芯片的下表面放置磁源，使用渐进式磁力吸附方式使磁珠外泌体偶联体进入纳米孔阵列；
S6、保持磁珠外泌体偶联体稳定吸附，利用PBS缓冲液清洗基片的上表面，静置后得到含有单外泌体的纳米微芯片。


2.根据权利要求1所述的纳米尺度单外泌体分离方法，其特征在于，步骤S1中，将含有外泌体的细胞培养液稀释至NTA定量测试外泌体浓度为1×107～1×109个/ml。


3.根据权利要求1所述的纳米尺度单外泌体分离方法，其特征在于，步骤S2中，超顺磁性氨基纳米磁珠的直径为50～150nm，纳米磁珠稀释液的浓度为1×107～1×1010个/ml，超顺磁性氨基纳米磁珠与待分离外泌体的混合粒子数之比为(5～20)：1。


4.根据权利要求3所述的纳米尺度单外泌体分离方法，其特征在于，超顺磁性氨基纳米磁珠与外泌体低频振动混合频率为20～50Hz，混合时间为3～5min。


5.根据权利要求1所述的纳米尺度单外泌体分离方法，其特征在于，步骤S3中，纳米孔阵...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄辰，刘涛，李国卿，何韬，杨树明，童东东，
申请(专利权)人：西安交通大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61