一株肠杆菌株及其在制备微生物多糖中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一株肠杆菌Kosakonia cowanii，菌株号LT‑1，已保藏于中国典型培养物保藏中心，登记入册的保藏号为(CCTCC No：M 2017850)，保藏日期为2017年12月29日。本发明专利技术还公开了该肠杆菌在合成微生物多糖中的应用。该菌株以蔗糖作为碳源，花生饼粉作为氮源时，微生物多糖产量可达到15.35～59.52g/L，蔗糖转化率高达57.83％～70.17％。本发明专利技术所述操作方法简单，生产成本低，对微生物多糖的工业化生产具有十分重要的意义。

【技术实现步骤摘要】
一株肠杆菌株及其在制备微生物多糖中的应用
本专利技术涉及一株肠杆菌KosakoniacowaniiLT-1菌株及利用该菌株产微生物多糖方法，它属于微生物学及生物工程

技术介绍
生物多糖广泛存在于微生物、大型真菌、动物和植物中，是天然界最丰富的聚合物之一。随着生物技术的高速发展，微生物多糖功能的研究也日益完善，成为免疫学、生物学和药学的研究热点。研究表明，微生物多糖由于其独特的化学结构、优越的物理化学性质、流变学特性以及本身的生物活性和营养价值，微生物多糖在各个领域均具有相关应用。此外，微生物多糖具有生产周期短、原料廉价、纯化简单以及可在人工控制下进行大规模工业化生产等动植物多糖所不具备的优势。因此，微生物多糖正迅速成为重要的新兴的生物材料。经检索，目前未见有使用肠杆菌K.cowanii发酵合成微生物多糖的专利报道。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供了一株产微生物多糖的菌株。本专利技术还要解决的技术问题是提供肠杆菌在制备微生物多糖中的应用。为解决上述问题，本专利技术采用如下技术方案：专利技术人在2017年从江苏省苏州市地区土壤中筛选得到一株肠杆菌，分类命名为KosakoniacowaniiLT-1，已保藏于中国典型培养物保藏中心”(简称CCTCC)，保藏地址：湖北省武汉市，洪山区八一路，武汉大学山国典型培养物保藏中心，邮编：430072，登记入册的保藏号为CCTCCNo：M2017850，保藏日期为2017年12月29日。以下内容均以此菌株作为生产菌株。所述菌株具有下述性质：1、菌落形态学特征与生理生化特性见表1。表1菌落形态学特征与生理生化特性2、16SrDNA序列分析：测得菌株的16SrDNA基因的核普酸序列长度为1388bp，其基因序列如SEQIDNo.1：所示。将所测序列从GeneBank数据库中使用BLAST程序进行同源性比较，构建16SrDNA全序列为基础的系统发育树。结果表明：菌株与肠杆菌HME8565达到100％同源性。根据菌株形态学观察和生理生化实验分析结果认定本专利技术所使用的是肠杆菌，具体为肠杆菌K.cowaniiLT-1。上述肠杆菌K.cowaniiLT-1在制备微生物多糖中的应用也在本专利技术的保护范围之内。利用上述肠杆菌K.cowaniiLT-1制备微生物多糖的具体的方法如下：将肠杆菌LT-1接种于斜面固体培养基，转接到种子培养基，最后接种于多糖发酵培养基中进行好氧培养，发酵液中富含有细菌微生物多糖。本专利技术所述肠杆菌K.cowaniiLT-1及其所述菌在制备微生物多糖的应用，依次包括以下步骤：1.培养基的配制：斜面培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉20g/L，自来水配置，调整pH值至7.0～7.2，121℃灭菌20min；液体种子培养基：蔗糖15g/L，花生饼粉3g/L，无机盐及金属离子1～2.5g/L，自来水配置，调整pH值至7.0～7.2，121℃灭菌20min；固体种子培养基：液体种子培养基，琼脂粉20g/L，自来水配置，调整pH值至7.0～7.2，121℃灭菌20min；富集液体培养基：蔗糖30g/L，酵母粉3g/L，硝酸钠3g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁0.4g/L，硫酸锰0.05g/L，琼脂粉20g/L，自来水配置，调整pH值至7.0～7.2，121℃灭菌20min；富集固体培养基：富集液体培养基、琼脂粉20g/L，自来水配置，调整pH值至7.0～7.2，121℃灭菌20min；发酵培养基：蔗糖30g/L，花生饼粉6g/L，硝酸钠6g/L，磷酸二氢钾0.3g/L，硫酸镁0.4g/L，硫酸锰0.04g/L，自来水配制，pH值调至7.0～7.2，121℃灭菌20min；2.菌种选择：选已保藏菌株肠杆菌K.cowaniiLT-1；3.菌种活化：将肠杆菌K.cowaniiLT-1菌种接种于斜面培养基，24～36℃静置培养24～36h，再次挑取单菌落划线到普通固体培养基上，24～36℃培养24～36h，得到活化菌种备用；4.种子培养：取步骤3中活化好的菌种，无菌条件下接种2～4环于种子液的摇瓶中，置于转速为200rpm的摇床上，温度为28～38℃培养24h，得到发酵种子液；5.发酵培养：将步骤(4)中发酵种子液在无菌条件下以4％～10％体积比的接种量，将种子液接种于发酵培养基摇瓶中，置于转速为200rpm的摇床上，28～38℃培养36～48h；当发酵液中多糖浓度不再上升时，发酵停止；6.多糖提取：(1)取步骤5中发酵液离心除去菌体，上清减压蒸馏至1/5体积后加入3～5倍体积的95％无水乙醇，离心取沉淀，沉淀用75％乙醇洗涤，再高速离心收集沉淀恒温干燥后可获得微生物多糖粗品；(2)将步骤(1)所得的多糖粗品溶解于25倍体积蒸馏水中，用Na2CO3调pH至7.0～8.0，加入质量为多糖1％～5％的胰蛋白酶，50～60℃水解1～2h后，用草酸调pH至5.0～6.0添加质量为多糖质量2‰～5‰的木瓜蛋白酶，60～70℃水解2～4h后，于100℃水浴加热4～6min，以终止酶反应；(3)将步骤(2)所得蛋白酶处理液用草酸调pH至7.0，加入3％三氯乙酸，搅拌，15,000rpm离心10～15min，取上清；(4)将步骤(3)所得清液加入1/3体积的Sevag试剂，充分震荡脱去蛋白，制得多糖溶液；(5)将步骤(4)所得多糖溶液用氨水调pH值至8.0，在50℃下滴加30％的H2O2，至溶液为浅黄色，保温1～2h，然后用草酸中和pH至7.0；蒸馏水透析2～4d后，冷冻干燥得多糖精品，并蒸馏回收酒精；7.多糖含量测定本专利技术利用苯酚硫酸法测定多糖含量：精密称取干燥恒重的葡萄糖，分别配置成0.000、0.005、0.010、0.015、0.020、0.025、0.030、0.035、0.040、0.045、0.050mg/mL的标准液，同时配置一定浓度的多糖溶液。精密吸取各标准液和多糖溶液0.2mL，分别置于试管内，各加5％苯酚试剂0.1mL和浓硫酸0.5mL，立刻摇匀。沸水加热15min，冰浴，以0mg/mL的标准液作空白对照，在490nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程，并计算多糖的含量。有益效果：本专利技术具有如下优势：(1)本专利技术筛选得到一株微生物多糖生产菌株，该菌株在多糖发酵过程以廉价的蔗糖作为碳源，廉价的花生饼粉作为氮源，合成微生物多糖，大大节约成本，操作方便简单。(2)该菌株发酵合成微生物多糖，产量可达到17.35～59.52g/L，蔗糖转化率高达57.83％～70.17％。大大降低了生产成本，对于微生物多糖的生产具有十分重要的意义和经济价值。附图说明图1为肠杆菌LT-1的16SrDNAPCR纯化琼脂糖本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株肠杆菌Kosakonia cowanii，菌株号LT-1，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No：M 2017850，保藏日期为2017年12月29日。/n

【技术特征摘要】
1.一株肠杆菌Kosakoniacowanii，菌株号LT-1，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNo：M2017850，保藏日期为2017年12月29日。


2.权利要求1所述的肠杆菌在制备微生物多糖中的应用。


3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，将肠杆菌LT-1接种于发酵培养基中进行好氧培养，发酵得到微生物多糖。


4.根据权利要求3所述的应用，其特征在，所述发酵培养基中的碳源为蔗糖。


5.根据权利要求3所...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴凌天，李柯铖，郗栋南，黎宇航，吴金男，董雯，卢艳，
申请(专利权)人：常熟理工学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32