一种新型冠状病毒2019-nCoV抗体谱检测试剂盒的生产方法技术

本发明专利技术涉及一种新型冠状病毒2019‑nCoV抗体谱检测试剂盒的生产方法，属于新型冠状病毒2019‑nCoV检测技术领域。利用本发明专利技术提供的生产方法得到的检测试剂盒包括桶装试纸条、瓶装样本稀释液、瓶装洗脱液、瓶装检测抗体、瓶装底物A、瓶装底物B、孵育槽、镊子、说明书、自封袋。本发明专利技术提供的生产方法中运用重组免疫印迹法制备检测试纸条，不同于传统的免疫印迹法，无需进行蛋白凝胶电泳和转膜，直接在硝酸纤维素膜上进行划线处理，大大简化了检测试剂盒的生产方法，缩短了制备时间，可在短时间内大批量生产检测试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
一种新型冠状病毒2019-nCoV抗体谱检测试剂盒的生产方法
本专利技术涉及一种新型冠状病毒2019-nCoV抗体谱检测试剂盒的生产方法，属于新型冠状病毒2019-nCoV检测

技术介绍
免疫印迹法(Westernblotting)是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术相结合的杂交技术。免疫印迹法具有分析容量大、敏感度高、特异性强等优点，是检测蛋白质特性、表达与分布的一种最常用的方法，用于组织抗原的定性定量检测、多肽分子的质量测定及病毒的抗体或抗原检测等。传统免疫印迹法分三个阶段进行。第一阶段为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)：抗原等蛋白样品经SDS处理后带阴电荷，在聚丙烯酰胺凝胶中从阴极向原理阳极泳动，分子量越小，泳动速度就越快。此阶段分离效果肉眼不可见(只有在染色后才显出电泳区带)。第二阶段为电转移：将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上，选用低电压和大电流，通电45min转移即可完成。此阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见。第三阶段为酶免疫定位：将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜(相当于包被了抗原的固相载体)依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色。常用的HRP底物为3,3'-二氨基联苯胺(呈棕色)和4-氯-1-萘酚(呈蓝紫色)。阳性反应的条带清晰可辨，并可根据SDS-PAGE时加入的分子量标准，确定各组分的分子量。传统免疫印迹法综合了SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高特异性和敏感性，是一个有效的分析手段，不仅广泛应用于分析抗原组分及其免疫活性，并可用于疾病的诊断。但是该方法操作繁琐、步骤多，生产工艺复杂，不易形成商品化的产品。目前，血清抗体检测主要是免疫层析法，该方法操作简单，对设备要求低，甚至无需检测设备；检测时间短；对于检测环境要求不高，一般15分钟左右即可出结果。该方法的缺点是侧向层析方法使用1种最多2种蛋白进行检测，没有清洗过程，由于个别患者血液中含有类风湿因子、异嗜性抗体、自身抗体，以及药物和肿瘤细胞等，易造成试验的交叉反应，出现假阳性的结果。也有少部分的免疫印迹法，但是试纸条制备需要通过电泳和转膜操作，仪器和操作要求高。因此，急需一种生产和使用方便、适合大规模的人群筛查、能避免假阴性和假阳性问题、灵敏度和特异性高、可以用于病程监控和疫苗效果评价的新型冠状病毒检测试剂盒。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述问题，本专利技术提供了一种新型冠状病毒2019-nCoV抗体谱检测试剂盒的生产方法。本专利技术提供的生产方法中运用重组免疫印迹法制备检测试纸条，不同于传统的免疫印迹法，无需进行蛋白凝胶电泳和转膜，直接在硝酸纤维素膜上进行划线处理，大大简化了检测试剂盒的生产方法，缩短了制备时间，同时，通过完成对各液体组分的配制、分装，包装等工艺流程完成检测试剂盒的生产。本专利技术提供了一种新型冠状病毒2019-nCoV抗体谱检测试剂盒的生产方法，技术方案如下：一种新型冠状病毒2019-nCoV抗体谱检测试剂盒的生产方法，所述生产方法是分别制备检测试纸条、样本稀释液、洗脱液、检测抗体和底物，将制备完成的检测试纸条、样本稀释液、洗脱液、检测抗体和底物，通过分装、组合、包装后形成检测试剂盒；其中，所述检测试纸条的制备方法包括以下步骤：(1)将新型冠状病毒抗原和羊抗鼠IgG分别在硝酸纤维素膜上进行划线；所述新型冠状病毒抗原为重组S1蛋白、重组RBD蛋白、重组N蛋白，或，所述新型冠状病毒抗原为重组S1蛋白、重组RBD蛋白、重组E蛋白，或，所述新型冠状病毒抗原为重组S1蛋白、重组RBD蛋白、重组N蛋白、重组E蛋白；(2)35-39℃烘干处理1-3小时；(3)将步骤(2)中烘干后的硝酸纤维素膜完全浸入封闭液中，15-25℃条件下，浸泡0.5-2小时；(4)35-39℃烘干处理1-3小时；(5)将步骤(4)中烘干后的硝酸纤维素膜固定在PVC胶板上，再在PVC胶板短边的一端贴上印有流水号的标签纸，切成3.5-4.0mm宽的试纸条，，即为新型冠状病毒2019-nCOV抗体谱检测试纸条。进一步地，步骤(2)和步骤(4)所述烘干在湿度≤30％环境中进行。进一步地，所述检测试纸条、样本稀释液、洗脱液、检测抗体和底物的制备过程均在10万级环境下进行。进一步地，所述样本稀释液为pH为7-8的磷酸盐缓冲液，配制完在10万级环境下通过蠕动泵分装到样本稀释液瓶中。进一步地，所述洗脱液为添加了吐温-20的pH为7-8的磷酸盐缓冲液，配制完在10万级环境下通过蠕动泵分装到洗脱液瓶中。进一步地，所述检测抗体为辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgG抗体或IgM抗体或IgA抗体或IgE抗体，配制完在10万级环境下通过蠕动泵分装到检测抗体瓶中。进一步地，步骤(1)划线前，利用蛋白稀释液对新型冠状病毒抗原和羊抗鼠IgG进行稀释，所述蛋白稀释液的制备方法是称取磷酸氢二钠55.8g，磷酸二氢钠5.5g，氯化钠9g；加纯水999mL溶解，吸取1mLproClin300至溶液中，搅拌混匀，定容至1000mL，常温放置备用。进一步地，步骤(3)所述封闭液的制备方法是称取磷酸氢二钠55.8g，磷酸二氢钠5.5g，氯化钠9g；称取牛血清白蛋白10g，加纯水900mL溶解，加入NaOH溶液调整pH至7.4。吸取1mLproClin300至溶液中，搅拌混匀，定容至1000mL。2-8℃条件下放置备用。进一步地，所述样本稀释液的制备方法是称取磷酸氢二钠55.8g，磷酸二氢钠5.5g，氯化钠9g；加纯水999mL溶解，吸取1mLproClin300至溶液中，搅拌混匀，定容至1000mL，常温放置备用。进一步地，所述洗脱液的制备方法是称取磷酸氢二钠55.8g，磷酸二氢钠5.5g，氯化钠9g；加纯水997.5mL溶解，分别吸取1mLproClin300和1.5mL吐温-20至溶液中，搅拌混匀，定容至1000mL。常温放置备用。进一步地，所述底物中含三羟甲基氨基甲烷、H2O2和3,3-二氨基联苯胺。进一步地，所述底物的制备方法是将底物A和底物B等体积混合；所述底物A的配制方法是称取三羟甲基氨基甲烷1.21g，加纯水900mL溶解，加HCl调整pH至pH7.5。定容至1000mL，常温放置备用；所述底物B的配制方法是量取30％H2O20.1mL，称取3,3-二氨基联苯胺0.01g，定容至100mL。2-8℃条件放置备用。进一步地，所述检测抗体的制备方法是将辣根过氧化物酶(HRP)标记的鼠抗人IgG抗体使用抗体稀释液进行稀释，使其终浓度为0.5μg/mL，混匀，2-8℃条件下放置备用；所述抗体稀释液的制备方法是称取磷酸氢二钠55.8g，磷酸二氢钠5.5g，氯化钠9g；称取牛血清白蛋白20g，加纯水900mL溶解，加NaOH溶液调整pH至pH7.5。吸取1mLproClin300至溶液中，搅拌混匀，定容至1000mL。2-8℃条件下放置备用。进一步地，所述检测试纸条的宽本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种新型冠状病毒2019-nCoV抗体谱检测试剂盒的生产方法，其特征在于，所述生产方法是分别制备检测试纸条、样本稀释液、洗脱液、检测抗体和底物，将制备完成的检测试纸条、样本稀释液、洗脱液、检测抗体和底物通过分装、组合、包装后形成检测试剂盒；其中，所述检测试纸条的制备方法包括以下步骤：/n(1)将新型冠状病毒抗原和羊抗鼠IgG分别在硝酸纤维素膜上进行划线；所述新型冠状病毒抗原为重组S1蛋白、重组RBD蛋白、重组N蛋白，或，所述新型冠状病毒抗原为重组S1蛋白、重组RBD蛋白、重组E蛋白，或，所述新型冠状病毒抗原为重组S1蛋白、重组RBD蛋白、重组N蛋白、重组E蛋白；/n(2)35-39℃烘干处理1-3小时；/n(3)将步骤(2)中烘干后的硝酸纤维素膜完全浸入封闭液中，15-25℃条件下，浸泡0.5-2小时；/n(4)35-39℃烘干处理1-3小时；/n(5)将步骤(4)中烘干后的硝酸纤维素膜固定在PVC胶板上，再在PVC胶板短边的一端贴上印有流水号的标签纸，切成3.5-4.0mm宽的试纸条，即为新型冠状病毒2019-nCOV抗体谱检测试纸条。/n

【技术特征摘要】
1.一种新型冠状病毒2019-nCoV抗体谱检测试剂盒的生产方法，其特征在于，所述生产方法是分别制备检测试纸条、样本稀释液、洗脱液、检测抗体和底物，将制备完成的检测试纸条、样本稀释液、洗脱液、检测抗体和底物通过分装、组合、包装后形成检测试剂盒；其中，所述检测试纸条的制备方法包括以下步骤：
(1)将新型冠状病毒抗原和羊抗鼠IgG分别在硝酸纤维素膜上进行划线；所述新型冠状病毒抗原为重组S1蛋白、重组RBD蛋白、重组N蛋白，或，所述新型冠状病毒抗原为重组S1蛋白、重组RBD蛋白、重组E蛋白，或，所述新型冠状病毒抗原为重组S1蛋白、重组RBD蛋白、重组N蛋白、重组E蛋白；
(2)35-39℃烘干处理1-3小时；
(3)将步骤(2)中烘干后的硝酸纤维素膜完全浸入封闭液中，15-25℃条件下，浸泡0.5-2小时；
(4)35-39℃烘干处理1-3小时；
(5)将步骤(4)中烘干后的硝酸纤维素膜固定在PVC胶板上，再在PVC胶板短边的一端贴上印有流水号的标签纸，切成3.5-4.0mm宽的试纸条，即为新型冠状病毒2019-nCOV抗体谱检测试纸条。


2.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(4)所述烘干在湿度≤30％环境中进行。

【专利技术属性】
技术研发人员：吴玉章，吴长龙，
申请(专利权)人：无锡市孚维尔生物医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32