一种铜离子标记的用于检测内毒素的胶体金试纸条及其制备和检测方法技术

本发明专利技术涉及一种铜离子标记的用于检测内毒素的胶体金试纸条及其制备和检测方法。一种铜离子标记的用于检测内毒素的胶体金试纸条，所述的试纸条包括底板以及依次搭接固定于底板上的样品垫、连接垫、硝酸纤维膜和吸收垫；所述的连接垫固定有铜离子标记的胶体金探针；所述的硝酸纤维膜上设置有检测线和质控线；所述的检测线固定有适配体捕获探针；所述的质控线固定有链霉亲和素；本发明专利技术同时公开了一种采用上述铜离子标记的胶体金试纸条检测内毒素的方法。本发明专利技术通过铜离子介导的金纳米颗粒聚集体和亲和性高的适配体作为检测探针和捕获探针，与传统的胶体金试纸条相对比特异性强、检测限低、灵敏度高，显色效果好。

【技术实现步骤摘要】
一种铜离子标记的用于检测内毒素的胶体金试纸条及其制备和检测方法
本专利技术涉及一种铜离子标记的用于检测内毒素的胶体金试纸条及其制备和检测方法，属于生物化学检测

技术介绍
内毒素是革兰氏阴性菌外膜的组成成分之一，微量内毒素可以引起体温升高和一系列有害症状，如腹泻、哮喘、血管内凝血及感染性休克等。因此，快速、灵敏的检测内毒素对食品安全及医疗用品至关重要。传统的检测内毒素的方法多基于鲎试验法和家兔热源检查法，但这两种方法主要是通过酶催化反应，因此测定结果易受到酶的影响，从而导致测试结果不准确，同时灵敏度低、检测限高、检测耗时长。近年来，生物传感器引起了广泛的关注。例如，多肽生物传感器、蛋白生物传感器、抗体生物传感器以及适配体生物传感器，可以特异性识别内毒素分子，虽然这些传感器在一定程度上改善了灵敏度、降低了检测限，但存在检测较为复杂、特异性不强、耗时长以及成本高等缺点，同时专业性要求很高，对于非专业的人很难操作，局限于实验室研究，尚未应用于现场快速检测。中国专利文献CN104698159A公开了一种内毒素含量的检测方法，包括以下步骤：S1配制至少五个含不同浓度的内毒素标准液；S2将鲎试剂稀释液分别与每个内毒素标准液按比例混合；S3分别对每个混合液采用血栓弹力图仪检测弹力达到0.1振幅时所需的时间，并绘制时间-内毒素浓度的双对数图，得出标准曲线图；S4将鲎试剂稀释液与待测样品液按照特定比例混合，随后采用血栓弹力图仪检测弹力达到0.1振幅时所需的时间，并与标准曲线图对比，从而得出待测样品液中的内毒素含量。但是该方法依然存在操作繁琐复杂，检测耗时长的缺点。中国专利文献CN105116142A公开了一种新型细菌内毒素检测试纸及检测方法，Phos-tag结合内毒素的磷酸基团，多粘菌素B与内毒素的类脂肪A相结合，可以快速、方便、及时检测，但是该专利的具有检测试纸特异性不强的问题。目前，基于铜离子标记的胶体金探针和适配体为捕获探针的试纸条未见报道。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种铜离子标记的用于检测内毒素的胶体金试纸条及其制备和检测方法，该试纸条通过铜离子介导的金纳米颗粒聚集体在检测线(T线)上产生一个红色色带，由标记物显色来检测内毒素，不需要专业人员检测，操作快速简便，结果准确可靠、形象直观。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种铜离子标记的用于检测内毒素的胶体金试纸条，所述的试纸条包括底板以及依次搭接固定于底板上的样品垫、连接垫、硝酸纤维膜和吸收垫；所述的连接垫固定有铜离子标记的胶体金探针；所述的硝酸纤维膜上设置有检测线和质控线；所述的检测线固定有适配体捕获探针；所述的质控线固定有链霉亲和素。根据本专利技术优选的，所述的适配体捕获探针为5’端生物素修饰的适配体，再通过链霉亲和素固定，共同形成的适配体-生物素-链霉亲和素结构。根据本专利技术优选的，所述的样品垫、连接垫、硝酸纤维膜和吸收垫相互重叠2～3mm，检测线和质控线的间隔为3～6mm，底板宽度为4mm。根据本专利技术优选的，所述适配体的序列为5’-CTTCTGCCCGCCTCCTTCC-TAGCCGGATCGCGCTGGCCAGATGATATAAAGGGTCAGCCCCCCA-GGAGACGAGATAGGCGGACACT-3’。本专利技术还公开了所述铜离子标记的用于检测内毒素的胶体金试纸条的制备方法，包括以下步骤：S1：制备样品垫；S2：制备连接垫，并将铜离子标记的胶体金探针固定在连接垫上，并在室温下干燥；S3：硝酸纤维膜的处理：通过三维划膜喷金仪将适配体捕获探针和链霉亲和素固定在硝酸纤维素膜上得到检测线和质控线；S4：试纸条的组装：将所述的样品垫、连接垫、硝酸纤维素膜和吸收垫依次固定在所述底板上，得到铜离子标记的用于检测内毒素的胶体金试纸条。根据本专利技术优选的，所述S1的步骤具体为：将玻璃纤维置于含有0.25％的聚乙二醇辛基苯基醚(曲拉通X-100)、0.05mol/L三羟甲基氨基甲烷、5％吐温-20和0.15mol/L氯化钠的缓冲溶液(pH＝8.0)中浸泡1h，然后在室温下干燥并储存于干燥器中。该处理方法可以有效的促进待测样品流动，减少在样品垫上的滞留。根据本专利技术优选的，所述S2中的铜离子标记的胶体金探针按如下方法制备：首先通过柠檬酸钠还原法制备金纳米粒子，然后在金纳米粒子的表面修饰上半胱胺分子，将复合溶液以8000rpm的转速离心10min，去除游离的半胱胺分子，最后加入铜离子标准溶液，促使金纳米粒子发生团聚，同样以8000rpm的转速离心10min，去除未吸附的铜离子，丢弃上清液，得到铜离子标记的胶体金探针，将得到的红色颗粒重新分散于50μL的含有20mmol/LNa3PO4、5％BSA、0.25％吐温-20和10％蔗糖的洗脱缓冲溶液中，用于固定探针且促使探针从连接垫上释放，减少非特异性吸附在硝酸纤维素膜上。进一步优选的，金纳米粒子、半胱胺分子、铜离子的摩尔比为150:1:1.5。根据本专利技术优选的，利用上述铜离子标记的用于检测内毒素的胶体金试纸条检测内毒素的方法，包括步骤如下：(1)将待测样品分散于磷酸盐缓冲溶液中得到待测液；(2)将待测液滴加在样品垫上，在0.5～2min后得到试纸显色结果；检测线和质控线均显红色，待测样品中含有内毒素；检测线无色，质控线显红色，待测样品中无内毒素。根据本专利技术优选的，所述的磷酸缓冲液的浓度为0.005～0.015mol/L。本专利技术的检测原理和技术特点：本专利技术的胶体金试纸条基于核酸适配体结合胶体金显色原理制成，目标分子内毒素可以与铜离子标记的胶体金探针特异性吸附、生物素修饰的适配体捕获探针特异性结合在检测线上形成三明治结构，且产生红色色带。本专利技术铜离子标记的胶体金探针制备过程中，金纳米粒子是通过柠檬酸钠还原制备得到，该方法可以确保由金纳米粒子制备的铜离子标记的胶体金探针能提供一个用于比色测定的强表面等离子体带；金纳米粒子、半胱胺、铜离子的摩尔比为150:1:1.5，避免了铜离子量过少时，会使目标分子内毒素捕捉到的铜离子标记的胶体金探针较少，从而使色带颜色变浅，检测效果变差；铜离子量过多时，会使半胱胺功能团化的金纳米粒子团聚程度变大，影响显色。本专利技术利用上述基于铜离子标记的的内毒素胶体金检测试纸检测内毒素的方法中，将样品垫通过含有0.25％的聚乙二醇辛基苯基醚(曲拉通X-100)、0.05mol/L三羟甲基氨基甲烷、5％吐温-20和0.15mol/L氯化钠的缓冲溶液(pH＝8.0)中浸泡1h处理可以有效的促进待测样品流动，减少在样品垫上的滞留，并且使得检测线及质控线的色带显示更加清晰。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：(1)本专利技术制备的胶体金试纸条，由于铜离子介导的金纳米颗粒聚集体和亲和性高的适配体作为检测探针和捕获探针，与传统的胶体金试纸条相对比特异性强、检测限低、灵敏度高，显色效果好，可以根据检测线和质控线的显色情况本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种铜离子标记的用于检测内毒素的胶体金试纸条，其特征在于，所述的试纸条包括底板以及依次搭接固定于底板上的样品垫、连接垫、硝酸纤维膜和吸收垫；/n所述的连接垫固定有铜离子标记的胶体金探针；所述的硝酸纤维膜上设置有检测线和质控线；所述的检测线固定有适配体捕获探针；所述的质控线固定有链霉亲和素。/n

【技术特征摘要】
1.一种铜离子标记的用于检测内毒素的胶体金试纸条，其特征在于，所述的试纸条包括底板以及依次搭接固定于底板上的样品垫、连接垫、硝酸纤维膜和吸收垫；
所述的连接垫固定有铜离子标记的胶体金探针；所述的硝酸纤维膜上设置有检测线和质控线；所述的检测线固定有适配体捕获探针；所述的质控线固定有链霉亲和素。


2.如权利要求1所述的铜离子标记的用于检测内毒素的胶体金试纸条，其特征在于，所述适配体捕获探针为5’端生物素修饰的适配体，再通过链霉亲和素固定，共同形成的适配体-生物素-链霉亲和素结构。


3.如权利要求1所述的铜离子标记的用于检测内毒素的胶体金试纸条，其特征在于，所述样品垫、连接垫、硝酸纤维膜和吸收垫相互重叠2～3mm，检测线和质控线的间隔为3～6mm，底板宽度为4mm。


4.如权利要求2所述的铜离子标记的用于检测内毒素的胶体金试纸条，其特征在于，所述适配体的序列为5’-CTTCTGCCCGCCTCCTTCC-TAGCCGGATCGCGCTGGCCAGATGATATAAAGGGTCAGCCCCCCA-GGAGACGAGATAGGCGGACACT-3’。


5.如权利要求1所述的铜离子标记的用于检测内毒素的胶体金试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：制备样品垫；
S2：制备连接垫：并将铜离子标记的胶体金探针固定在连接垫上，并在室温下干燥；
S3：硝酸纤维膜的处理：通过三维划膜喷金仪将适配体捕获探针和链霉亲和素固定在硝酸纤维素膜上得到检测线和质控线；
S4：试纸条的组装：将所述的样品垫、连接垫、硝酸纤维素膜和吸收垫依次固定在所述底板上，得到铜离子标记的用于检测内毒素的胶体金试纸条。


6.如权利要求5所述的铜离子标记的用于检测内毒素...

【专利技术属性】
技术研发人员：林猛，段杨杨，李源，王南，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东;37