一种3D立体免疫荧光染色试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术提出了一种3D立体免疫荧光染色试剂盒及其应用，该试剂盒包括包括固定液、细胞膜打孔液、封闭液、PBS缓冲液、一抗、荧光二抗、脱水剂和离子交换树脂，所述细胞膜打孔液是在0.1M PBS溶液中加入2.5％蔗糖、20％DMSO、5％Tween‑20和5％Triton X‑100充分搅拌溶解后制得。利用本发明专利技术试剂盒及免疫荧光染色方法可以对大组织整体荧光标记，相比传统免疫荧光染色，将组织内某一层面的蛋白定位提升到3D立体蛋白定位标记，实现更精准的绝对定量分析。

【技术实现步骤摘要】
一种3D立体免疫荧光染色试剂盒及其应用
本专利技术涉及免疫荧光染色领域，尤其涉及一种3D立体免疫荧光染色试剂盒及其应用。
技术介绍
免疫荧光染色技术是一种以免疫学为基础，结合生物化学技术和显微技术发展而来的蛋白等分子检测技术。免疫荧光技术利用了抗原与抗体高度特异性结合的原理，将某种可测定的物质偶联到抗体或者抗原上，通过检测标记物的有无和含量，对样品中待检抗原或抗体进行定性、定位和定量检测。Coons等于1941年首次采用荧光素标记抗体进行抗原定位而获得成功。尤其近三十几年来，免疫荧光技术是标记免疫技术中发展最快、应用最广的一项技术，具有特异性强、灵敏度高、检测速度快和便于观察等优点。免疫荧光染色及成像分析是研究细胞组织形态和原位抗原表达不可或缺的检测技术，广泛应用于临床病理诊断和医学及生物学研究的各个领域。传统的免疫荧光染色方法是用普通的石蜡切片利用抗体标记组织内的抗原反应，再用荧光素进行显色的方法。经由免疫荧光染色的样本通常包含多维的生物学信息，包括组织结构信息、不同细胞型的空间分布信息、不同信号通路蛋白或细胞功能标志物的共表达信息等，对这些信息的完整记录和充分解读，对于研究疾病发生发展的机制、探讨诊断和治疗疾病的有效方法有着重要意义。然而，传统的免疫荧光染色方法存在的很大不足是只能标记某一层面的蛋白定位，免疫荧光图像的评判多采用人工计数来观察阳性着色面积比例和分布这种半定量分析方式，分析受到很大的局限性；即便使用连续切片成像，由于切片厚度的限制和损耗，即使连续的两张切片之间也难以做到纳米级的精准对齐，无法保持细胞的连贯性，也不能进行单细胞级别的共定位分析。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提出了一种3D立体免疫荧光染色试剂盒及其应用，可以实现大组织整体荧光标记，并进行三维立体成像的数据分析。本专利技术的技术方案是这样实现的：一方面，本专利技术提供了一种3D立体免疫荧光染色试剂盒，包括固定液、细胞膜打孔液、封闭液、PBS缓冲液、一抗、荧光二抗、脱水剂和离子交换树脂，所述固定液为乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和多聚甲醛中的至少一种，所述一抗为待检测抗原的特异性结合抗体，所述荧光二抗为荧光标记的抗所述一抗的抗体。在以上技术方案的基础上，优选的，所述所述细胞膜打孔液为含2.5％(w/w)蔗糖、20％(v/v)DMSO、5％(v/v)Tween-20和5％(v/v)TritonX-100的PBS溶液。在以上技术方案的基础上，优选的，所述封闭液为含10％(v/v)血清的叠氮化钠溶液。在以上技术方案的基础上，优选的，所述脱水剂包括四氢呋喃梯度溶液。在以上技术方案的基础上，优选的，所述四氢呋喃梯度溶液各梯度中四氢呋喃所占的体积比分别为50％、75％、95％和100％。另一方面，本专利技术还提供了所述3D立体免疫荧光染色试剂盒在免疫荧光染色中的应用。在以上技术方案的基础上，优选的，所述应用包括如下步骤：S1、取组织样本置于离心管中，加入固定液固定24h以上，弃液体，用PBS缓冲液清洗2-3次，每次8h；S2、加入细胞膜打孔液，于37℃气加热振荡器中孵育7-21d进行打孔，打孔完成后弃液体，用PBS缓冲液清洗2-3次，每次2h；S3、加入封闭液，于37℃气加热振荡器中孵育3d进行封闭，封闭完成后弃液体，用PBS缓冲液清洗2-3次，每次2h；S4、加入能充分覆盖样本的一抗，并加入0.1％叠氮化钠溶液进行防腐处理，于37℃气加热振荡器中孵育14-21d，一抗孵育完成后弃液体，用PBS缓冲液清洗2-3次，每次8h；S5、加入用PBS缓冲液稀释100倍的荧光二抗，并加入0.1％叠氮化钠溶液进行防腐处理，于37℃气加热振荡器中孵育7d，二抗孵育完成后弃液体，用PBS缓冲液清洗2-3次，每次8h；S6、将荧光标记后的样本置于脱水剂中，于4℃条件下进行避光脱水处理；S7、用离子交换树脂对脱水后样本于4℃条件下进行避光渗透处理；S8、用离子交换树脂包埋样本，放入3D扫描仪成像。在以上技术方案的基础上，优选的，所述PBS缓冲液清洗是置于混旋仪中进行旋转清洗。在以上技术方案的基础上，优选的，所述混旋仪为美国精骐数显转速可调试管混匀器。在以上技术方案的基础上，优选的，步骤S2中，所述打孔过程中每隔24h换液一次。在以上技术方案的基础上，优选的，所述渗透处理具体包括，渗透3h后换新的树脂单体进行渗透，然后每隔24h换液一次，72h后渗透完成。本专利技术的3D立体免疫荧光染色试剂盒及其应用相对于现有技术具有以下有益效果：(1)本专利技术能对大组织整体进行荧光标记，最后通过3D扫描仪扫描得到视频形式的3D数字成像结果及蛋白阳性数据分析，相较于传统的免疫荧光能做到绝对定量分析及更大范围的蛋白标记；(2)传统免疫荧光染色制作石蜡切片时组织要经过无水乙醇和二甲苯在超过60℃条件下的高温处理，这样大大损失了组织样本的活性，而本专利技术的3D立体免疫荧光染色能取材局部组织块通过较为温和的通透方式保护组织的活性，从而更好的让抗体与组织内抗原结合实现蛋白定位标记。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为实施例2中大鼠脑整体明场图像。图2为实施例2中大鼠脑胶质细胞荧光标记主视图。图3为实施例2中大鼠脑胶质细胞荧光标记转面图。图4为实施例2中大鼠脑胶质细胞荧光标记左视图。图5为实施例2中大鼠脑胶质细胞荧光标记5倍放大图。图6为实施例2中大鼠脑胶质细胞荧光标记10倍放大图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施方式，对本专利技术实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本专利技术一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本专利技术中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本专利技术保护的范围。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本专利技术所用的试剂和原料均为公知技术，为本领域技术人员熟知的技术，而且在市场上很容易购得。实施例1本实施例提供了一种3D立体免疫荧光染色试剂盒，其包括如下试剂：(1)0.MPBS缓冲液。(2)0.1％(w/v)叠氮化钠溶液。(3)固定液：乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛、多聚甲醛。(4)细胞膜打孔液：含2.5％(w/w)蔗糖、20％(v/v)DMSO、5％(v/v)Tween-20和5％(v/v)TritonX-100的PBS溶液。配制方法：先配制0.1M的PBS缓冲液，再向其中加入2.5g蔗糖、20mLDMSO、5mLTween-20和5mLT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种3D立体免疫荧光染色试剂盒，其特征在于：包括固定液、细胞膜打孔液、封闭液、PBS缓冲液、一抗、荧光二抗、脱水剂和离子交换树脂，所述固定液为乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和多聚甲醛中的至少一种，所述一抗为待检测抗原的特异性结合抗体，所述荧光二抗为荧光标记的抗所述一抗的抗体。/n

【技术特征摘要】
1.一种3D立体免疫荧光染色试剂盒，其特征在于：包括固定液、细胞膜打孔液、封闭液、PBS缓冲液、一抗、荧光二抗、脱水剂和离子交换树脂，所述固定液为乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和多聚甲醛中的至少一种，所述一抗为待检测抗原的特异性结合抗体，所述荧光二抗为荧光标记的抗所述一抗的抗体。


2.如权利要求1所述的3D立体免疫荧光染色试剂盒，其特征在于：所述细胞膜打孔液为含2.5％(w/w)蔗糖、20％(v/v)DMSO、5％(v/v)Tween-20和5％(v/v)TritonX-100的PBS溶液。


3.如权利要求1所述的3D立体免疫荧光染色试剂盒，其特征在于：所述封闭液为含10％(v/v)血清的叠氮化钠溶液。


4.如权利要求1所述的3D立体免疫荧光染色试剂盒，其特征在于：所述脱水剂包括四氢呋喃梯度溶液。


5.如权利要求4所述的3D立体免疫荧光染色试剂盒，其特征在于：所述四氢呋喃梯度溶液各梯度中四氢呋喃所占的体积比分别为50％、75％、95％和100％。


6.权利要求1-5任一所述的3D立体免疫荧光染色试剂盒的应用，其特征在于，包括如下步骤：
S1、取组织样本置于离心管中，加入固定液固定24h以上，弃液体，用PBS缓冲液清洗2-3次，每次8h；
S2、加入细胞膜打孔液，于37℃气加热振荡器中孵育7-21d...

【专利技术属性】
技术研发人员：冷毅斌，吴娟，马力，杨行，桑达斯，寇小娟，
申请(专利权)人：武汉巴菲尔生物技术服务有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42