一种单唾液酸四己糖神经节苷脂的合成方法技术

本发明专利技术涉及一种工业合成单唾液酸四己糖神经节苷脂的方法，以氟代乳糖(Lac‑F)为原料，经过10种酶催化的五步连续反应制备单唾液酸四己糖神经节苷脂，并达到由克级至公斤级的制备规模，从而满足了工业生产GM1的需求，取代了传统从猪脑提取的工艺路线。另外，本专利将制备单唾液酸四己糖神经节苷脂的工艺缩短为五步，并且在前三个步骤中未纯化中间产物，减少了因中间步骤纯化引起的产品损耗，节约了时间成本。

【技术实现步骤摘要】
一种单唾液酸四己糖神经节苷脂的合成方法
本专利技术涉及一种工业合成单唾液酸四己糖神经节苷脂的方法，属于生物化学催化合成

技术介绍
单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1)，系自猪脑中提取制得的对神经细胞功能损伤具有作用的物质。其结构包括疏水的神经酰胺和亲水的带有唾液酸的寡糖链，两端通过糖苷键连接在一起。疏水的神经酰胺主要包含鞘氨醇和脂肪酸，二者通过亚氨基连接。鞘氨醇由多羟基脂肪胺构成，链长为18或20个碳原子，其结构式为：现有技术对于GM1的提取都立足于提高产品纯度、收率，降低产品成本，减少毒害有机溶剂的使用量等方面进行了大量的研究并且市场已有单唾液酸四己糖神经节苷脂注射液、注射用单唾液酸四己糖神经节苷脂等多种产品在销售使用。由于来源于生物原料猪脑，目前的提取技术不够精细，采用生物化学合成的方式获得的GM1是比较理想的方式。目前，合成GM1的技术存在一定的缺陷，合成周期长，步骤繁多，转化率低。截止目前，有研究利用氟代乳糖为原料制备肿瘤疫苗GM3，而尚未有以氟代乳糖(Lac-F)为原料制备GM1的专利技术；另外本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种单唾液酸四己糖神经节苷脂的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：/nA.采用第一组合酶将氟代乳糖、唾液酸与三磷酸胞苷催化生成GM3-F；/nB.采用N-乙酰半乳糖胺、三磷酸腺苷、三磷酸尿苷与GM3-F在第二组合酶的作用下催化生成GM2-F；/nC.采用半乳糖、三磷酸腺苷、三磷酸尿苷与GM2-F在第三组合酶的作用下生产GM1-F；/nD.采用第四酶将GM1-F在醇的作用下催化生成GM1-Sph；/nE.用烷基酰氯与GM1-Sph合成得到单唾液酸四己糖神经节苷脂。/n

【技术特征摘要】
1.一种单唾液酸四己糖神经节苷脂的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
A.采用第一组合酶将氟代乳糖、唾液酸与三磷酸胞苷催化生成GM3-F；
B.采用N-乙酰半乳糖胺、三磷酸腺苷、三磷酸尿苷与GM3-F在第二组合酶的作用下催化生成GM2-F；
C.采用半乳糖、三磷酸腺苷、三磷酸尿苷与GM2-F在第三组合酶的作用下生产GM1-F；
D.采用第四酶将GM1-F在醇的作用下催化生成GM1-Sph；
E.用烷基酰氯与GM1-Sph合成得到单唾液酸四己糖神经节苷脂。


2.根据权利要求1所述的一种单唾液酸四己糖神经节苷脂的合成方法，其特征在于：
步骤A中所述第一组合酶为NmCSS、PmST1和PmPpA；
步骤B中所述第二组合酶为NahK、AGX1、PmPpA和CgtA，所述步骤B采用N-乙酰半乳糖胺与三磷酸尿苷、三磷酸腺苷在NahK、AGX1、PmPpA三种酶的作用下生成第一中间产物UDP-GalNac，然后UDP-GalNac与GM3-F在酶CgtA的作用下催化生成GM2-F；
步骤C中所述第三组合酶为GalK、AtUSP、PmPpA和CgtB，步骤C采用半乳糖、三磷酸腺苷和三磷酸尿苷在GalK、AtUSP、PmPpA三种酶的作用下生成第二中间产物UDP-Gal；然后UDP-Gal与GM2-F在酶CgtB的作用下生产GM1-F；
步骤D中所述第四酶为EGCII，步骤D采用酶EGCII将GM1-F、鞘氨醇在含乙醇体系下催化生成GM1-Sph；
步骤E采用十八碳酰氯与GM1-Sph合成GM1-C18，或采用二十碳酰氯和GM1-Sph合成GM1-C20。


3.根据权利要求2所述的单唾液酸四己糖神经节苷脂的合成方法，其特征在于步骤A中：
所述氟代乳糖的摩尔浓度为10-40mM；
所述氟代乳糖、唾液酸和三磷酸胞苷的摩尔浓度比为1：(1.2-2)：(1.3-2)；
所述NmCSS的用量为80-140U；
所述PmST1的用量为80-220U；
反应温度为10-40℃，pH值为7-9。


4.根据权利要求2所述的单唾液酸四己糖神经节苷脂的合成方法，其特征在于步骤A中：
所述氟代乳糖的摩尔浓度为30mM；
所述氟代乳糖、唾液酸和三磷酸胞苷的摩尔浓度比为1：1.7：1.6；
所述NmCSS的用量为100U；
所述PmST1的用量为180U；
反应温度为30℃，pH值为9。


5.根据权利要求2所述的单唾液酸四己糖神经节苷脂的合成方法，其特征在于步骤B中：
所述N-乙酰半乳糖胺的浓度为20-50mM；
所述N-乙酰半乳糖胺、三磷酸腺苷与三磷酸尿苷的摩尔浓度比为1：(1.2-1.3)：(1.2-1.3)；
所述NahK的用量为200-260U；
所述AGX1的用量为120-270U；
所述生成第一中间产物反应温度为30-42℃，pH值为7-9；
所述GM3-F的浓度10-30mM；
所述GM3-F与第一中间产物的摩尔浓度比为1：1；
所述CgtA添加量为100-300U；
所述GM3-F与第一中间产物的反应温度为25-40℃，pH值为7-9。

【专利技术属性】
技术研发人员：王鹏，曹学峰，
申请(专利权)人：武汉糖智药业有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42