一种同时测定血液和玻璃体液中乙醇非氧化代谢物的方法技术

本发明专利技术属分析化学及司法鉴定技术领域，涉及测定血液和玻璃体液中乙醇非氧化代谢物的方法，尤其是一种同时测定血液和玻璃体液中2类乙醇非氧化代谢物硫酸乙酯和葡萄糖醛酸乙酯的方法，该方法检材用量少、灵敏度高、特异性强、线性范围宽，并且操作简单、快速、提取溶剂用量少、分析时间短，能够满足司法鉴定任务紧迫、对检测时间要求高的需求，可大范围推广应用。该方法可以同时应用于血液和玻璃体液两种常规检材，与单纯的血液相比可提供玻璃体液中EtG和EtS的结果作为参考，弥补单一检材测定存在的问题，提高检测结果的可靠性。

【技术实现步骤摘要】
一种同时测定血液和玻璃体液中乙醇非氧化代谢物的方法
本专利技术属分析化学及司法鉴定
，涉及测定血液和玻璃体液中乙醇非氧化代谢物的方法。具体涉及一种同时测定血液和玻璃体液中2类乙醇非氧化代谢物的方法，尤其是人血液和玻璃体液中硫酸乙酯和葡萄糖醛酸乙酯的同时检测方法。该方法检材用量少、灵敏度高、特异性强、线性范围宽，并且操作简单、快速、提取溶剂用量少、分析时间短，能够满足司法鉴定任务紧迫、对检测时间要求高的需求，可大范围推广应用。
技术介绍
现有技术公开了葡萄糖醛酸乙酯(EtG)和硫酸乙酯(EtS)是乙醇的非氧化代谢物，由乙醇经Ⅱ相代谢产生，所述代谢物是判断乙醇摄入的生物标志物。有实践显示EtG和EtS在血液中的检测时限可以达到18h，能弥补传统的血液中乙醇检测窗口短(6-8h)的不足。有研究提出，如司法鉴定
，EtG和EtS可用于区分尸体血液中所检测到的乙醇是来源于生前饮酒还是死后腐败产生，然而，研究表明，在高度腐败的尸体中，由于受微生物的干扰，EtG和EtS在血液中可能存在降解现象；同时，亦有研究表明，EtG还存在于死后产生的现象，因此，在有关司法鉴定
单纯使用血液作为检材的可靠性值得商榷。据记载，由于具有受到眼眶的保护及相对隔绝的解剖特点，玻璃体液作为一种无菌检材，不容易受到微生物侵入和死后产生乙醇的污染，可以提高EtG和EtS在其中的稳定性，因而，结合血液和玻璃体液中的检测结果，可显著减小误判的概率，如尸体血液中检出EtG和EtS，而玻璃体液中未检出，则可判定血液中的EtG和EtS为死后产生，能有效避免单独检测血液可能出现的错误结果。基于现有技术的现状，尤其在司法鉴定领域，迫切需要建立一种分析方法，可同时用于血液和玻璃体液中EtG和EtS的同时测定；该方法旨在弥补血液中乙醇检测的缺陷，同时能够解决单独检测血液或玻璃体液中的乙醇非氧化代谢物存在的问题，将为司法鉴定中判断当事人是否摄入乙醇提供一种准确可靠的新方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是基于现有技术的现状以及为弥补血液中乙醇检测中存在的缺陷，提供一种同时测定血液和玻璃体液中乙醇非氧化代谢物的方法，尤其是一种能同时测定人血液和玻璃体液中2种乙醇的非氧化代谢物—葡萄糖醛酸乙酯(EtG)和硫酸乙酯(EtS)的方法。本专利技术公开了一种对血液和玻璃体液中2类乙醇非氧化代谢物：葡萄糖醛酸乙酯(EtG)和硫酸乙酯(EtS)进行定性和定量分析的方法，主要包括下述步骤：(1)样品预处理将血液和玻璃体液检材转移至加入了内标离心管中，加入甲醇，涡旋后离心，转移上清液后吹干，初始流动相复溶；(2)采用液相色谱－串联质谱联用法测定检材中2类乙醇非氧化代谢物的浓度；采用的色谱柱为PhenomenexSynergi2.5μmHydro-RP100Acolumn(2mm×100mm,2.5μm)，柱温40℃；本专利技术的实施例中，在样品预处理中，所述的内标含EtG-d5和EtS-d5各1μg/mL；其中，涡旋后离心12000rpm，10min；其中，所述的初始流动相为0.1％甲酸水溶液；本专利技术的实施例中，采用液相色谱－串联质谱联用法测定检材血液和玻璃体液中乙醇非氧化代谢物葡萄糖醛酸乙酯(EtG)和硫酸乙酯(EtS)的浓度；检测样品时，将20μL检材(血液和玻璃体液)转移至加入了2μL含EtG-d5和EtS-d5各1μg/mL内标的离心管中，随后加入甲醇100μL，涡旋5min后离心12000rpm，10min，转移上清液后吹干，50μL初始流动相(0.1％甲酸水溶液)复溶；本专利技术的该方法样品用量少，前处理过程简便、快速，易于操作；尤其是所采用的血液和玻璃体液样品用量少，仅为20μL；且同时将血液和玻璃体液作为检材，有效弥补了单一检材存在的不足；本专利技术方法中，采用液相色谱－串联质谱联用法对血液和玻璃体液中的EtG和EtS进行定性和定量分析，同时分别对血液和玻璃体液的分析方法进行方法学验证的考察，考察内容包括：选择性、线性、准确度、精密度(包括批内精密度和批间精密度)、提取回收率和基质效应；结果显示，本专利技术方法对血液和玻璃体液中乙醇的2类非氧化代谢物进行定性和定量分析，结果准确、可靠；灵敏度、准确度和精密度均符合专业要求；表1显示了检测目标物的色谱保留时间和质谱特征峰；各化合物检测限、定量限及线性范围如表2-1和表2-2所示；血液中的提取回收率在78.0-90.1％范围内，准确度在87.2-106.7％范围内，批内精密度的RSD不超过8.2％，批间精密度的RSD不超过12.2％；玻璃体液中的提取回收率范围在94.8-100.9％之间，准确度在91.2-107.2％之间，批内精密度的RSD不超过5.9％，批间精密度的RSD不超过5.5％。表1血液和玻璃体中检测目标物的色谱保留时间和质谱参数注：粗体为定量离子对。表2-1血液中检测目标物的检测限、定量限及线性范围目标物表2-2玻璃体液中检测目标物的检测限、定量限及线性范围本专利技术方法与现有技术的方法相比，具有以下明显优势：(1)建立了一种可以同时应用于血液和玻璃体液中EtG和EtS检测的液相色谱－串联质谱联用法方法，弥补了对一种检材单独进行检测的不足；本方法包括了EtG和EtS的同时定性及定量分析，灵敏度和线性范围能够满足司法鉴定的要求。(2)本方法使用的生物检材用量少因而适用范围广；本方法采用20μL血液和玻璃体液制作为检材，用量极少，在实际检案中，尤其是涉及死亡时间较长的案例，可以应对检材量非常有限的情况。(3)本方法灵敏度高，在血液和玻璃体液中EtG和EtS的检测限均能达到2ng/mL，相较于对比文献，显著提升了两种乙醇的非氧化代谢物的检测灵敏度。附图说明图1是EtG和EtS标准品，定量限浓度5ng/mL，添加提取后进样的标准色谱图，其中，A：血液中EtG；B：血液中EtS；C：玻璃体液中EtG；D：玻璃体液中EtS。具体实施方式实施例1色谱条件如下：色谱柱：PhenomenexSynergi2.5μmHydro-RP100Acolumn(2mm×100mm,2.5μm)；柱温：40℃流动相：水(0.1％甲酸)(A相)；乙腈(0.1％甲酸)(B相)；梯度洗脱(见表3)，流速0.25mL/min。进样量：5μL表3梯度洗脱条件质谱条件如下：ESI；喷雾电压：3.6kV(+)/2.8kV(-)；鞘气：35Arb；辅助气：10Arb；离子传输管温度：350℃；脱溶剂温度：300℃；扫描方式：多反应监测(MRM)检测目标物的色谱保留时间和质谱数据：如表1所示；样品处理：取检材20μL(血液或玻璃体液)，加入2μL混合内标工作溶液，涡旋20s混匀后，加入装有100μL甲醇的2mL微量离心(EP)管中。随后，在涡旋混合器上涡旋5min并置于高本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种同时测定血液和玻璃体液中乙醇非氧化代谢物的方法，其特征在于，所述的方法定性和定量分析乙醇非氧化代谢物葡萄糖醛酸乙酯EtG和硫酸乙酯EtS，按下述步骤：/n(1)样品预处理/n将检材转移至加入了内标的离心管中，加入甲醇，涡旋后离心，转移上清液后吹干初始流动相(0.1％甲酸水溶液)复溶；/n(2)采用液相色谱－串联质谱联用法测定血液和玻璃体液中2类乙醇非氧化代谢物的浓度；采用的色谱柱为Phenomenex Synergi 2.5μm Hydro-RP 100A column(2mm×100mm,2.5μm)，柱温40℃。/n

【技术特征摘要】
1.一种同时测定血液和玻璃体液中乙醇非氧化代谢物的方法，其特征在于，所述的方法定性和定量分析乙醇非氧化代谢物葡萄糖醛酸乙酯EtG和硫酸乙酯EtS，按下述步骤：
(1)样品预处理
将检材转移至加入了内标的离心管中，加入甲醇，涡旋后离心，转移上清液后吹干初始流动相(0.1％甲酸水溶液)复溶；
(2)采用液相色谱－串联质谱联用法测定血液和玻璃体液中2类乙醇非氧化代谢物的浓度；采用的色谱柱为PhenomenexSynergi2.5μmHydro-RP100Acolumn(2mm×100mm,2.5μm)，柱温40℃。


2.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的检材为血液和玻璃体液。...

【专利技术属性】
技术研发人员：饶渝兰，王昊，黄志斌，樊恩杉，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海;31