Dkk-3蛋白功能性片段及其应用制造技术

本公开提供了一种Dkk‑3蛋白功能性片段及其应用。具体来说，本公开揭示了一种由氨基酸编码的Dkk‑3蛋白的不同片段在肌肉萎缩中的功能。其中，Dkk‑3蛋白的N端片段具有诱导肌肉萎缩的完整功能，Dkk‑3蛋白的L‑CDR2‑C片段具有拮抗N端片段诱导肌肉萎缩的功能。本公开还提供了以Dkk‑3蛋白的特定位点为靶点治疗肌肉萎缩的药物，Dkk‑3蛋白的L‑CDR2‑C片段本身或其融合蛋白可以作为拮抗Dkk‑3诱导肌肉萎缩功能的靶向药物。

【技术实现步骤摘要】
Dkk-3蛋白功能性片段及其应用
本公开涉及生物
，具体涉及肌肉萎缩相关的蛋白质分子标记Dkk-3蛋白的功能性片段、前述功能性片段的筛选及其应用。
技术介绍
Dkk蛋白家族(Dickkopffamilyprotein)属于分泌型的糖蛋白，包括五个家族成员，分别是Dkk-1、Dkk-2、Dkk-3、Dkk-4和DkkL1(Niehrs，2006)。Dkk蛋白家族成员的蛋白结构包括N端的信号肽(Signalpeptide)，两个半胱氨酸富集区(Cysteine-richdomain，CRD)(DkkL1除外)以及连接两个半胱氨酸富集区的连接肽段(Linker)(见图2)。每一个CRD区域都存在十个保守的半胱氨酸位点。靠近N端的CRD1为Dkk蛋白家族所特有(Krupniketal.，1999)。另一个靠近C端(碳端)的半胱氨酸富集区CRD2在蛋白质序列上与共脂肪酶折叠区(Colipasefold)的功能域相似(AravindandKoonin，1998)。与功能研究相似，在Dkk蛋白家族中，结构研究较多家族成员是Dkk-1和Dkk-2。将Dkk-1和Dkk-2从连接肽段处分为N段和C段，二者的C段均能够与LRP6受体结合。Dkk-1的N段能够抑制Dkk-1的C段与LRP6的结合，Dkk-2的N段则没有类似功能(BrottandSokol，2002)。这可能解释了Dkk-1和Dkk-2在爪蟾发育中的不同功能(BrottandSokol，2002)。这些结果提示，Dkk蛋白家族中，不同成员的N段结构域的功能可能不相同，甚至存在很大差异，部分结构域与全长蛋白的功能有可能完全相反。与Dkk-1及Dkk-2相比，目前针对Dkk-3结构域功能的研究还比较少。2008年，Abarzua等人研究发现Dkk-3N端78个氨基酸组成的结构域是Dkk-3诱导人前列腺癌细胞发生内质网应激反应和细胞凋亡的最主要区域(Abarzuaetal.，2008)。2015年，Kinoshita等人发现，Dkk-3诱导单核细胞向树突状细胞分化，激活细胞毒性T淋巴细胞，引起抗肿瘤免疫反应的重要功能结构域为CRD1和CRD2区域(Kinoshitaetal.，2015)。这说明，在不同类型细胞中，行使不同生物学功能时，Dkk-3起主要作用的结构域可能并不相同。Dkk-1能够通过抑制Wnt信号通路从而诱导非洲爪蟾头部发育的起始(Glinkaetal.，1998)。Dkk-2的功能也与Wnt信号通路紧密相连。但与Dkk-1不同，Dkk-2在不同细胞中，对Wnt信号通路的调控方向不同。其对Wnt信号通路的影响却既有激活又有抑制(Wuetal.，2000)。Dkk-4的功能与Dkk-1相似，也能通过结合LRP5/6受体，对Wnt信号通路进行负调控(Krupniketal.，1999)。DkkL1到目前为止，功能研究几乎处于空白状态。与其它Dkk家族成员不同，Dkk-3不能与LRP5/6和Kremen受体结合(MaoandNiehrs，2003；Lietal.，2002；BrottandSokol，2002)，在Wnt信号通路中的作用及机制仍不清楚。很多报道表明Dkk-3不影响Wnt信号通路(Abarzuaetal.，2005)。但是，也有报道认为Dkk-3能够抑制Wnt信号通路(Caricasoleetal.，2003；Hoangetal.，2004)。相反，也有文章认为Dkk-3能增强Wnt信号通路(Nakamuraetal.，2007)。上述研究表明，在不同类型的细胞，不同细胞状态等不同背景下，Dkk-3的功能可能都不相同。Dkk-3是一个公认的肿瘤抑制因子(VeeckandDahl，2012)。非肿瘤疾病中，Dkk-3的研究较少。已知Dkk-3的表达水平与动脉粥样硬化(Yuetal.，2017)，肾纤维化(Federicoetal.，2016)，阿尔兹海默症(Zhangetal.，2017)及肌肉萎缩(Yinetal.，2018)密切相关。目前针对Dkk-3在骨骼肌中的相关研究还很少。现有研究表明，在不同类型的小鼠骨骼肌中，Dkk-3的表达量存在差异。在股四头肌中表达水平较高，在腓肠肌和比目鱼肌中表达水平相对较低，但并没有深入研究具体是哪一类型肌肉中Dkk-3表达量较高(deWildeetal.，2010)。另外，在斑马鱼胚胎肌肉发育过程中，Dkk-3能够正调控成肌因子Myf5的表达，从而促进肌肉发育(Fuetal.，2012)。上述研究揭示了Dkk-3在肌肉的发育和分化过程中有非常重要的调控作用。Dkk-3不仅在肌肉的发育和分化中起重要的作用，而且与由衰老引起的肌肉萎缩密切相关。Dkk-3的表达水平在衰老肌肉中显著提高。同时，在肌肉萎缩患者的外周血中，Dkk-3的蛋白水平显著升高，提示Dkk-3可以成为肌肉萎缩的血液诊断标志物(Yinetal.，2018)。利用腺病毒在年轻小鼠胫骨前肌中过表达Dkk-3，胫骨前肌肌肉质量下降，肌纤维横截面积明显变小，肌肉力量下降，肌肉发生了肌肉萎缩现象。相反，在老年小鼠胫骨前肌中敲低Dkk-3表达水平，胫骨前肌的肌纤维横截面积增大，肌肉质量显著增加，更重要的是肌肉收缩力量恢复，这提示Dkk-3是引起肌肉萎缩的重要因素，Dkk-3可能成为新的肌肉萎缩的治疗靶点(Yinetal.，2018)。肌少症(sarcopenia)或称“肌肉减少症”，源于希腊语，“sarx”意为肌肉，“penia”意为减少或丢失，这是个新名词，于1989年由Rosenberg首次命名。2010年欧洲老年肌少症工作组(EuropeanWorkingGrouponSarcopeniainOlderPeople，EWGSOP)发表了肌肉萎缩共识。此后，国际肌少症工作组(InternationalWorkingGrouponSarcopenia，IWGS)也公布了新共识，将肌少症定义为：“与增龄相关的进行性、全身肌量减少和/或肌强度下降或肌肉生理功能减退”。肌少症与活动障碍、跌倒、低骨密度及代谢紊乱密切相关，是老年人生理功能逐渐减退的重要原因和表现之一。肌肉少症会增加老年人的住院率及医疗花费，严重影响老年人的生活质量，甚至缩短老年人的寿命。目前还没有以老年肌肉萎缩为适应症的药物，扩展使用的药物副作用大而效果有限。运动疗法和营养疗法的效果更有限。
技术实现思路
专利技术要解决的问题基于现有技术中存在的问题，本公开提供一种治疗肌肉萎缩，特别是老年肌肉萎缩的药物。用于解决问题的方案(1)一种蛋白，所述蛋白由氨基酸序列编码，其中，所述氨基酸序列选自以下序列：(a)所述氨基酸序列与SEQIDNO：3所示的序列相比，具有80％以上且90％以下的同源性；优选的，具有82％以上且86％以下的同源性；更优选的，具有84％以上且85％以下的同源性。(2)如(1)所述的蛋白，其特征在于，所述核苷酸的序列为如SEQIDNO：4所示的序列。(3本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种蛋白，所述蛋白由氨基酸序列编码，其中，所述氨基酸序列选自以下序列：/n(a)所述氨基酸序列与SEQ ID NO：3所示的序列相比，具有80％以上且90％以下的同源性；优选的，具有82％以上且86％以下的同源性；更优选的，具有84％以上且85％以下的同源性。/n

【技术特征摘要】
1.一种蛋白，所述蛋白由氨基酸序列编码，其中，所述氨基酸序列选自以下序列：
(a)所述氨基酸序列与SEQIDNO：3所示的序列相比，具有80％以上且90％以下的同源性；优选的，具有82％以上且86％以下的同源性；更优选的，具有84％以上且85％以下的同源性。


2.如权利要求1所述的蛋白，其特征在于，所述核苷酸的序列为如SEQIDNO：4所示的序列。


3.一种蛋白，所述蛋白由氨基酸序列编码，其中，所述氨基酸序列选自以下序列：
(b)所述氨基酸序列与SEQIDNO：5所示的序列相比，具有75％以上且84％以下的同源性；优选的，具有77％以上且82％以下的同源性；更优选的，具有79％以上且80％以下的同源性；
可选的，所述氨基酸序列中氨基酸的数量比SEQIDNO：5所示的氨基酸数量多1个。


4.如权利要求3所述的蛋白，其特征在于，所述氨基酸序列为如SEQIDNO：6所示的序列。


5.一种核酸，所述核酸编码如权利要求1-4任一项所述的蛋白。


6.一种遗传修饰的载体，其特征在于，所述载体包含核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列编码如权利要求1-4任一项所述的蛋白；可选的，所述核苷酸序列包含如SEQIDNO：8所示的序列或如SEQIDNO：10所示的序列。


7.一种表达蛋白的细胞，其含有如权利要求6所述的载体。


8.一种抗体或其片段，所述抗体或其片段竞争性地结合权利要求1-2任一项所述的蛋白；优选的，所述抗体为单克隆抗体。


9.一种制备蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：
(s1)将权利要求6所述的载体转染表达蛋白的细胞；
(s2)收集步骤(s1)中的所述细胞表达的所述蛋白。


10.一种制备单克隆抗体的方法，所述方法包括以下步骤(s1)-(s3)或以下步骤(s1)-(s2)、(s4)：
(s1)将权利要求6所述的载体转染表达蛋白的细胞；
(s2)收集步骤(s1)中的所述细胞表达的蛋白；
(s3)用步骤(s2)获得的蛋白免疫动物，从被免疫动物的淋巴细胞中分离特异性识别所述蛋白的所述单克隆抗体；或者
(s4)用步骤(s2)获得的蛋白筛选单克隆抗体噬菌体展示文库，得到特...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴思，胡苹，
申请(专利权)人：苏州神肌赢生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32