一种丁酸梭菌的快速筛选方法技术

本发明专利技术涉及一种丁酸梭菌的快速筛选方法，属于微生物领域，包括以下步骤：取待筛选的丁酸梭菌菌株，经活化、平板分离初筛、孔板复筛、试管斜面培养和摇瓶培养，得到高产丁酸的丁酸梭菌；所述的平板分离初筛培养基中添加有溴甲酚绿。本发明专利技术的筛选方法增加了固体平板菌落筛选，将肉眼观察不到的产量性状转化为可见的形态变化，提高了平板挑选菌落的目的性；用孔板代替摇瓶，单次筛选量增加，同时孔板效价检测利用酶标仪，单次检测量成倍提升，大大的提高了筛选效率。

【技术实现步骤摘要】
一种丁酸梭菌的快速筛选方法
本专利技术涉及微生物领域，特别是涉及一种丁酸梭菌的快速筛选方法。
技术介绍
菌种是发酵的根本，每一发酵产品的生产水平跨越式提高都与菌种技术进步密不可分。因而提高丁酸发酵的工业生产水平，对丁酸工业产生菌进行选育，获得高产、遗传稳定的菌株，始终是丁酸研究工作中的一个热点，其中菌种筛选技术是获得高产菌株的关键。目前丁酸生产主要以合成法为主，关于发酵法生产丁酸的高产菌种的获得，文章和专利可见的研究较少。发酵法生产丁酸的高产菌种的常规筛选程序包括突变体文库构建，平板分离初步筛选，摇瓶发酵筛选和HPLC定量鉴定。常规筛选方法具有以下缺点：首先，传统的平板分离初步筛选是在普通的平板培养基下，平板上只是长出单菌落，但是单菌落的好坏未知，需要后续通过摇瓶考察其效价的高低来确定，筛选效率不高且操作较为繁琐；其次，摇瓶培养过程对于物料和人工的消耗都较大；再次，HPLC的高成本和低效率进一步限制了高通量筛选目标的达成。尽管还有许多其他检测丁酸的分析方法，但所有方法都是费时或高成本的，导致无法有效、经济地检测丁酸。因此，迫切需要开发一种简单，快速，低成本的高通量筛选方法来筛选具有良好性能的丁酸菌。
技术实现思路
为了解决现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种丁酸梭菌的快速筛选方法。本专利技术提供的筛选方法，提高了平板挑选菌落的目的性，可以大大的提高具有一定生产水平的丁酸梭菌菌株的筛选效率。为解决上述技术问题，本专利技术提供了以下技术方案：本专利技术提供了一种筛选丁酸梭菌的平板分离初筛培养基，包括以下质量百分含量的组分：蛋白胨8％-12％、酵母浸粉8％-12％、葡萄糖0.5％-1％、NaCl2％-7％、溴甲酚绿0.5％-0.7％、琼脂1.3％-1.6％和余量的水。本专利技术提供了一种筛选丁酸梭菌的平板分离初筛方法，包括以下步骤：将活化后的丁酸梭菌菌株种子液涂布于上述的平板分离初筛培养基中，于35℃-37℃厌氧培养24-48h，测量平板分离初筛培养基上单菌落产生的变色圈直径，变色圈直径≥0.5cm且分离度好的单菌落即为初筛合格的丁酸梭菌。本专利技术还提供了一种丁酸梭菌的快速筛选方法，包括以下步骤：(1)将上述初筛合格的丁酸梭菌进行孔板复筛得到丁酸梭菌的种子液，检测所得种子液的丁酸含量；(2)选取步骤(1)中丁酸含量较原始初筛合格的丁酸梭菌提升≥5％的菌株作为复筛优株进行试管斜面培养和摇瓶培养，检测摇瓶培养后所得种子液的丁酸含量；摇瓶培养后所得种子液中较复筛优株丁酸含量提升≥5％的菌株即为筛选得到的丁酸梭菌。优选的，所述孔板复筛包括96孔板厌氧培养和48孔板厌氧培养；所述96孔板厌氧培养时间为12-17h；所述48孔板厌氧培养时间为24-48h。优选的，所述试管斜面培养为厌氧培养；所述厌氧培养的温度为35℃-37℃，所述厌氧培养的时间为24-48h。优选的，所述试管斜面培养的培养基，以水为溶剂，包括以下组分：蛋白胨8-12g/L、酵母浸粉8-12g/L、葡萄糖0.5-1g/L、NaCl2-7g/L、琼脂1.3-1.6g/L。优选的，所述摇瓶培养包括摇瓶液体种子培养和摇瓶液体发酵培养；所述摇瓶培养的温度为35℃-37℃。优选的，所述摇瓶液体种子培养的培养基以水为溶剂，包括以下组分：蛋白胨8-12g/L、酵母浸粉8-12g/L、葡萄糖5-8g/L、NaCl2-7g/L以及溶剂水；所述摇瓶液体发酵培养的培养基以水为溶剂，包括以下组分：蛋白胨8-12g/L、酵母浸粉8-12g/L、葡萄糖10-12g/L、NaCl2-7g/L以及溶剂水。优选的，所述摇瓶液体种子培养的时间为12-17h；所述摇瓶液体发酵培养的时间为24-48h。与现有技术相比，本专利技术具有以下的有益效果：1、本专利技术提供了一种利用平板变色圈快速筛选丁酸梭菌的方法，该方法将肉眼观察不到的产量性状转化为可见的形态变化，利用指示剂，在平板单菌落上就能进行初步的筛选，克服了初筛的盲目性，可以大大的提高筛选效率。2、本专利技术提供了一种丁酸梭菌的96孔板高通量筛选方法，确认了一套完整的孔板筛选工艺，检测时间降低了1.5倍，检测的菌株数量提高了9.6倍，为丁酸梭菌高产菌株的筛选提供了快速高效的方法。附图说明图1本专利技术丁酸梭菌筛选方法流程图。图2传统丁酸梭菌菌株筛选方法流程图。图3丁酸含量标准曲线图。具体实施方式本专利技术是基于工业微生物具有一定生产水平的丁酸梭菌菌株的快速筛选方法，建立了一套完善的丁酸的快速的高通量筛选方法，提高了菌株的筛选效率，避免了微生物在长期传代使用的过程中，产生退化，效能降低的问题，大大的提高了筛选效率。本专利技术提供了一种筛选丁酸梭菌的平板分离初筛培养基，包括以下质量百分含量的组分：蛋白胨8％-12％、酵母浸粉8％-12％、葡萄糖0.5％-1％、NaCl2％-7％、溴甲酚绿0.5％-0.7％、琼脂1.3％-1.6％和余量的水。本专利技术中，筛选丁酸梭菌的平板分离初筛培养基中添加有指示剂溴甲酚绿。本专利技术中，所述溴甲酚绿在所述平板分离初筛培养基的质量百分含量优选为0.5％-0.7％，更优选为0.6％。本专利技术所述的溴甲酚绿可与目标产物丁酸反应产生变色圈，发生颜色变化且不影响菌株的生长，能够通过变色圈大小快速的判定产目标产物丁酸的多少，提高筛选效率。本专利技术提供了一种筛选丁酸梭菌的平板分离初筛方法，包括以下步骤：将活化后的丁酸梭菌菌株种子液涂布于上述所述的平板分离初筛培养基中，于35℃-37℃厌氧培养24-48h，测量平板分离初筛培养基上单菌落产生的变色圈直径，变色圈直径≥0.5cm的单菌落即为初筛合格的丁酸梭菌。本专利技术中，将丁酸梭菌菌株接种于液体种子培养基中进行活化。本专利技术中所述液体种子培养基以水作为溶剂，优选包括以下组分：蛋白胨8-12g/L、酵母浸粉8-12g/L、葡萄糖5-8g/L、NaCl2-7g/L；更优选为包括以下组分：蛋白胨10g/L、酵母浸粉10g/L、葡萄糖6g/L、NaCl5g/L。本专利技术中，所述活化优选于厌氧条件下进行。所述活化的温度优选为35℃-37℃，更优选为36℃；所述活化的时间优选为12-17h，更优选为15h。本专利技术中，将活化后的丁酸梭菌菌株种子液涂布于平板分离初筛培养基前优选的还包括将所述活化后的丁酸梭菌菌株种子液进行稀释。本专利技术中所述稀释的方法优选为：取活化完的种子液1mL加入装有9mL无菌水的试管中摇匀即为10-1。本专利技术中将丁酸梭菌菌株种子液优选的稀释至10-2-10-8，更优选的稀释至10-5-10-7。本专利技术将丁酸梭菌菌株种子液涂布前进行稀释，避免菌落生长过密，有利于单菌落的收集。本专利技术还提供了一种丁酸梭菌的快速筛选方法，包括以下步骤：(1)将所述初筛合格的丁酸梭菌进行孔板复筛得到丁酸梭菌的种子液，检测所得种子液的丁酸含量；(2)选取步骤(1)中丁酸含量较原始初筛合格的丁酸梭菌提升≥5％的菌株作为复筛本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种筛选丁酸梭菌的平板分离初筛培养基，其特征在于，包括以下质量百分含量的组分：蛋白胨8％-12％、酵母浸粉8％-12％、葡萄糖0.5％-1％、NaCl 2％-7％、溴甲酚绿0.5％-0.7％、琼脂1.3％-1.6％和余量的水。/n

【技术特征摘要】
1.一种筛选丁酸梭菌的平板分离初筛培养基，其特征在于，包括以下质量百分含量的组分：蛋白胨8％-12％、酵母浸粉8％-12％、葡萄糖0.5％-1％、NaCl2％-7％、溴甲酚绿0.5％-0.7％、琼脂1.3％-1.6％和余量的水。


2.一种筛选丁酸梭菌的平板分离初筛方法，其特征在于，包括以下步骤：
将活化后的丁酸梭菌菌株种子液涂布于权利要求1所述的平板分离初筛培养基中，于35℃-37℃厌氧培养24-48h，测量平板分离初筛培养基上单菌落产生的变色圈直径，变色圈直径≥0.5cm的单菌落即为初筛合格的丁酸梭菌。


3.一种丁酸梭菌的快速筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将权利要求2中初筛合格的丁酸梭菌进行孔板复筛得到丁酸梭菌的种子液，检测所得种子液的丁酸含量；
(2)选取步骤(1)中丁酸含量较原始初筛合格的丁酸梭菌提升≥5％的菌株作为复筛优株进行试管斜面培养和摇瓶培养，检测摇瓶培养后所得种子液的丁酸含量；摇瓶培养后所得种子液中较复筛优株丁酸含量提升≥5％的菌株即为筛选得到的丁酸梭菌。


4.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，所述孔板复筛包括96孔板厌氧培养和48孔板厌氧培养；所述96孔板厌氧培养时间为12-17h；所述48孔板厌氧培养时间为24-48...

【专利技术属性】
技术研发人员：娄百勇，吕向云，刘娟，李冰，韩鹏军，杨永，曹华伟，远万里，
申请(专利权)人：驻马店华中正大有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41