一株高产岩藻糖基乳糖的酿酒酵母工程菌株及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种高产2’‑岩藻糖基乳糖的酿酒酵母工程菌株，通过代谢工程改造，使得酿酒酵母可以吸收乳糖并在胞内以GDP‑甘露糖为前体合成GDP‑岩藻糖，并通过异源表达来源于蜡样芽孢杆菌中的α‑1,2‑岩藻糖基转移酶，所得到的重组菌株可以高产2’‑岩藻糖基乳糖，为工业化生产2’‑岩藻糖基乳糖提供重要参考。

【技术实现步骤摘要】
一株高产岩藻糖基乳糖的酿酒酵母工程菌株及其应用
本专利技术属于基因工程领域，尤其涉及一株高产岩藻糖基乳糖，尤其是高产2’-岩藻糖基乳糖的重组酿酒酵母及其应用。
技术介绍
2’-岩藻糖基乳糖(2-FL)作为母乳寡糖中的重要组成部分，可以促进人体肠道内有益微生物如双歧杆菌等的生长，降低肠道内病原体感染的风险，还可以调控免疫应答。目前2-FL已在婴幼儿配方奶粉中作为添加剂使用。2-FL的大量合成具有良好的经济效益。化学合成2-FL过程中需添加有毒试剂，难以应用于食品工业。在生物体内合成2-FL是行之有效的方法。2-FL的生物合成过程已较为清楚：一分子供体GDP-岩藻糖在α-1,2-岩藻糖基转移酶的作用下与受体乳糖结合，产生一分子2-FL。现有技术中有研究构建了高产2-FL的大肠杆菌重组菌株。但是大肠杆菌可能产生内毒素，影响产品的分离纯化难度及产品安全性；另外大肠杆菌发酵时易受到噬菌体的污染，这使大肠杆菌工业化生产2-FL受到了制约。酿酒酵母是被普遍认为安全的微生物，已有研究利用酿酒酵母合成2-FL；但是，现有报道中酿酒酵母菌株合成的2-FL产量仅0.5g/L，难以满足工业化生产的需要。制约酿酒酵母中2-FL产量的重要因素之一为α-1,2-岩藻糖基转移酶的酶活性不足。寻找具有高活力的α-1,2-岩藻糖基转移酶可能会提高酿酒酵母中2-FL的产量。
技术实现思路
本专利技术通过代谢工程改造，使得酿酒酵母可以吸收乳糖并在胞内以GDP-甘露糖为前体合成GDP-岩藻糖，并通过异源表达来源于蜡样芽孢杆菌中的α-1,2-岩藻糖基转移酶，得到了高产2-FL的酿酒酵母工程菌株。一方面，本专利技术提供了一株高产2’-岩藻糖基乳糖的酿酒酵母工程菌株，所述酿酒酵母工程菌株中含有重组的乳糖透性酶(Lactosepermease)、重组的GDP-甘露糖脱水酶(GDP-mannose-4,6-dehydratase)、重组的GDP-岩藻糖合酶(GDP-L-fucosesynthase)以及重组的α-1,2-岩藻糖基转移酶(α-1,2fucosyltransferase)。本专利技术中，术语“重组”指通过转化将目的基因转移到酿酒酵母中；所述含有重组的目的基因的酿酒酵母工程菌株与其来源的野生型酿酒酵母相比，其已经以遗传方式修饰，从而展示出改变的或不同的基因型和/或表型。可以通过将目的蛋白通过载体在宿主菌中进行表达(包括过表达的方式)来实现，还可以通过将目的蛋白的编码基因重组到宿主菌的基因组上来实现。含有重组的目的基因的酿酒酵母工程菌株含有至少一个被引入的基因序列，此类基因序列包括但不限于天然存在或不存在酿酒酵母中的基因以及希望引入到酿酒酵母细胞中的其他基因或DNA序列，无论野生型的酿酒酵母中是否已经存在相同或类似的基因或DNA序列；在一些实施方式中，引入的基因序列将通过例如同源重组或定点诱变来修饰或甚至替代内源基因或DNA序列；在其他的实施方式中，引入到酿酒酵母工程菌株中的重组基因可以是与存在酿酒酵母中的DNA序列相同的并且被引入以提供DNA的一个或多个另外的拷贝，从而DNA的基因产物过表达或修饰的表达。在优选的实施方式中，所述α-1,2-岩藻糖基转移酶来源于蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)，更优选的，所述α-1,2-岩藻糖基转移酶的氨基酸序列如SEQIDNo.11所示。更优选的，所述酿酒酵母工程菌株包含重组的α-1,2-岩藻糖基转移酶的编码基因；优选的，所述编码基因的序列如SEQIDNo.12所示。优选的，所述乳糖透性酶来源于乳酸克鲁维斯酵母，更优选的，所述乳糖透性酶的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。优选的，所述GDP-甘露糖脱水酶和GDP-岩藻糖合酶来源于大肠杆菌，优选，来源于大肠杆菌K12，更优选的，所述GDP-甘露糖脱水酶的氨基酸序列如SEQIDNo.3所示，所述GDP-岩藻糖合酶的氨基酸序列如SEQIDNo.5所示。在优选的实施方式中，所述酿酒酵母工程菌株的出发菌株为酿酒酵母W303-1a。另一方面，本专利技术还提供了所述的酿酒酵母工程菌株的制备方法，所述方法包括将所述目的基因重组到酿酒酵母中的步骤。优选的，将所述目的基因整合到酿酒酵母的基因组中。进一步的，所述目的基因的整合位点包括TRP1、URA3或LEU2。另一方面，本专利技术还提供了所述酿酒酵母工程菌株在生产2’-岩藻糖基乳糖中的应用。本专利技术以酿酒酵母W303-1a为出发菌株。从克鲁维斯酵母总DNA中克隆出乳糖透性酶Lac12，构建表达盒Pgal1-lac12-Tcyc1，并通过无缝融合的方法将表达盒与pRS304连接。所得到的重组载体以限制性内切酶Bsu36I线性化后，通过醋酸锂转化法转入酿酒酵母W303-1a中，并通过色氨酸缺陷的YNB固体平板筛选得到阳性克隆。进一步PCR验证后，所得到的正确转化子命名为FL01。FL01可以吸收胞外添加的乳糖。从大肠杆菌K12总DNA中克隆出GDP-甘露糖脱水酶(Gmd)以及GDP-岩藻糖合成酶(WcaG)，以来源于pUMRI-A的双向启动子gal1,10构建双向表达盒Pgal1-gmd-Tcyc1&Pgal10-wcaG-Tadh1。将以上表达盒通过无缝融合的方法与pRS306连接，所得到的重组载体以NcoI限制性内切酶线性化，随后通过醋酸锂转化法转入FL01中，验证正确的重组菌株命名为FL03，该菌株可以吸收胞外的乳糖，同时可以以胞内的GDP-甘露糖为底物，合成GDP-岩藻糖。以包括Helicobactorpylori、Acetobactersp.、Bacilluscereus、Bacteroidesunifomis、Bacteroideseggerthii、Neocallimastixcaliforniae等菌株来源的α-1,2-岩藻糖基转移酶为基础，以PCR融合的方法构建表达盒，将表达盒连接在载体pRS305上，并通过醋酸锂转化法转入FL03中，其中，表达来源于Bacilluscereus的α-1,2-岩藻糖基转移酶的酿酒酵母重组菌株可以产生约2.9g/L的2-FL。现有技术中也有报道在酿酒酵母中合成2-FL，但是，所得到的酿酒酵母重组菌株中的2-FL产量仅为约0.5g/L。而本申请中利用来源于蜡样芽孢杆菌的α-1,2-岩藻糖基转移酶构建的酿酒酵母重组菌株，以半乳糖诱导相关基因的表达，发酵96h后2-FL产量可以达到2.9g/L，这为酿酒酵母工业化生产2-FL提供了重要的参考。附图说明图1.表达Lac12的酿酒酵母重组菌株可以将乳糖吸收至胞内；A，葡萄糖标准品；B，半乳糖标准品；C，乳糖标准品；D、E，表达Lac12的酿酒酵母重组菌株S-L胞内裂解液。图2.异源表达Gmd和WcaG的酿酒酵母重组菌株FL03可以产生GDP-岩藻糖；A，GDP-岩藻糖标准品；B，表达Lac12的酿酒酵母重组菌株FL01；C，表达乳糖转运体Lac12和GDP-岩藻糖合成相关酶WcaG和Gmd的酿酒酵母重组本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株高产2’-岩藻糖基乳糖的酿酒酵母工程菌株，其特征在于，所述酿酒酵母工程菌株中含有重组的乳糖透性酶(Lactose permease)、重组的GDP-甘露糖脱水酶(GDP-mannose-4,6-dehydratase)、重组的GDP-岩藻糖合酶(GDP-L-fucose synthase)以及重组的α-1,2-岩藻糖基转移酶(α-1,2fucosyltransferase)。/n

【技术特征摘要】
1.一株高产2’-岩藻糖基乳糖的酿酒酵母工程菌株，其特征在于，所述酿酒酵母工程菌株中含有重组的乳糖透性酶(Lactosepermease)、重组的GDP-甘露糖脱水酶(GDP-mannose-4,6-dehydratase)、重组的GDP-岩藻糖合酶(GDP-L-fucosesynthase)以及重组的α-1,2-岩藻糖基转移酶(α-1,2fucosyltransferase)。


2.根据权利要求1所述的酿酒酵母工程菌株，其特征在于，所述α-1,2-岩藻糖基转移酶来源于蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)；优选的，所述α-1,2-岩藻糖基转移酶的氨基酸序列如SEQIDNo.11所示。


3.根据权利要求1所述的酿酒酵母工程菌株，其特征在于，所述乳糖透性酶来源于乳酸克鲁维斯酵母；优选的，所述乳糖透性酶的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。


4.根据权利要求1所述的酿酒酵母工程菌株，其特征在于，所述GDP-甘露糖脱水酶来...

【专利技术属性】
技术研发人员：孟祥锋，刘巍峰，徐明远，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东;37