测定注射用透明质酸钠复合溶液中盐酸赖氨酸含量的方法技术

本发明专利技术公开了一种测定注射用透明质酸钠复合溶液中盐酸赖氨酸含量的方法。所述方法包括下述步骤：供试品溶液制备：利用透明质酸酶对注射用透明质酸钠复合溶液进行酶解；标准品溶液制备：将盐酸赖氨酸标准品溶解得到；检测步骤：使用高效液相色谱法，利用在线衍生技术，检测所述的供试品溶液和标准品溶液，使用外标法确定盐酸赖氨酸的含量。本发明专利技术使用透明质酸酶对供试品进行前处理，并结合液相色谱分离技术测得供试品中盐酸赖氨酸含量，方法准确度高，检测限低。按照本发明专利技术的方法，能够避免交联透明质酸钠对盐酸赖氨酸含量测定的干扰，提高检测准确度，降低检测限。同时又能够减少交联透明质酸钠复合溶液对色谱柱的损耗，延长色谱柱使用寿命。

【技术实现步骤摘要】
测定注射用透明质酸钠复合溶液中盐酸赖氨酸含量的方法
本专利技术涉及氨基酸检测的
，尤其涉及一种酶解法联合HPLC法测定注射用透明质酸钠复合溶液中盐酸赖氨酸含量的方法。
技术介绍
透明质酸(Hyaluronicacid，HA)是人和动物皮肤、玻璃体、关节润滑液和软骨组织的重要成分，一般为其钠盐，即透明质酸钠(Sodiumhyaluronate,SH)，习惯上仍称为透明质酸。分子式为(C14H21NO11)n，它由(1-β-4)D-葡糖醛酸和(1-β-3)N-乙酰基-D-氨基葡糖双糖单位重复连接而成，其聚合物在体内的分子量大小范围从5000至2000万道尔顿不等，被认为是一种填充空间、稳定结构、涂层细胞和保护细胞的多糖。透明质酸被广泛使用在修复手术、眼部手术或作为美容产品填充皱纹。透明质酸具有良好的理化性能及生物相容性。然而，它在体内受到透明质酸酶的酶解作用而迅速降解，存留时间较短，需要重复注射才能达到疗效。交联透明质酸是透明质酸经交联剂交联修饰得到的具有三维立体结构的高分子凝胶，可以弥补透明质酸钠存留时间短等缺点，同时仍具有良好的生物相容性及效果。注射用透明质酸钠复合溶液并不是单纯的交联透明质酸钠，还含有盐酸赖氨酸，其可以辅助成纤维细胞合成胶原蛋白。目前常用的氨基酸检测方法有电位滴定法、茚三酮显色法以及衍生化高效液相色谱法。例如中国专利申请号CN201910490795.1中公开了一种测定黄精红曲中游离氨基酸含量的方法，其使用的异硫氰酸苯酯为衍生化试剂，高效液相色谱法测定氨基酸含量，但是其衍生化步骤比较复杂，需要萃取处理，操作粗犷，影响含量测定结果。
技术实现思路
本专利技术人开发的方法中，利用邻苯二甲醛为衍生试剂，可使供试品在水溶液中与衍生化试剂直接反应，优化操作步骤，提高测定准确度。但是在衍生后检测盐酸赖氨酸含量时发现，注射用透明质酸钠复合溶液中盐酸赖氨酸的含量测定结果与投料量偏差较大，重复性差，怀疑注射用透明质酸复合溶液中交联透明质酸钠的复杂结构影响盐酸赖氨酸含量的检测；而且由于注射用透明质酸钠复合溶液的黏性容易堵塞色谱柱，柱效降低，影响检测结果，同时缩短柱子使用寿命。为了解决上述问题，本专利技术人对之前开发的方法、特别是供试品的前处理进行了优化，从而确定了酶解法联合使用高效液相色谱法测定注射用透明质酸复合溶液中盐酸赖氨酸含量的方法，将注射用透明质酸钠复合溶液中交联透明质酸钠特异性酶解后，进行盐酸赖氨酸的衍生化反应，能够大大提高注射用透明质酸钠复合溶液中盐酸赖氨酸含量的准确度，检测限低至10-4ppm，同时延长色谱柱的使用寿命，维持色谱柱柱效。本专利技术具体技术方案如下：本专利技术提供了测定注射用透明质酸钠复合溶液中盐酸赖氨酸含量的方法，其包含下述步骤：供试品溶液制备：利用透明质酸酶对注射用透明质酸钠复合溶液进行酶解；标准品溶液制备：将盐酸赖氨酸标准品溶解得到；检测步骤：使用高效液相色谱法，利用在线衍生技术，检测所述的供试品溶液和标准品溶液，使用外标法确定盐酸赖氨酸的含量。优选的，对于上述所述的方法，其中，所述透明质酸酶为细菌酶，优选的，在35-45℃酶解，进一步优选为42℃；优选的，酶解3-3.5h，进一步优选为2-3h；优选的，酶解pH为6.0-6.5。优选的，对于上述所述的方法，其中，在线衍生技术包括下述步骤：将所述供试品溶液与衍生化试剂在缓冲溶液存在下混合，优选的，所述缓冲溶液为硼酸盐缓冲溶液。优选的，对于上述所述的方法，其中，所述衍生化试剂为邻苯二甲醛。优选的，对于上述所述的方法，其中，在检测步骤中，使用的色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，优选为PoroshellHPH-C18色谱柱或者ZORBAEclipse-AAA色谱柱。优选的，对于上述所述的方法，其中，在检测步骤中，流动相采用体积比为90:10-98:2的弱碱溶液:甲醇，优选为97:3-98:2，进一步优选为98:2。优选的，对于上述所述的方法，其中，所述弱碱溶液为pH8.0-8.8的溶液，优选为8.2-8.4，进一步优选为8.2。优选的，对于上述所述的方法，其中，所述弱碱溶液为磷酸硼酸盐溶液，优选浓度为8-12mmol/L的磷酸硼酸盐溶液，进一步优选为8mmol/L的磷酸硼酸盐溶液。优选的，对于上述所述的方法，其中，在检测步骤中，采用的色谱条件为：流速为1.0-1.5ml/min，进一步优选为1.2-1.5ml/min，最优选为1.5ml/min；优选的，检测波长为220-250nm，优选为224-235nm，进一步优选为224nm；优选的，进样量为0.5-1.5μL，优选0.8-1μL，进一步优选为1μL；优选的，柱温为30-45℃，优选为40℃。优选的，对于上述所述的方法，其中，所述注射用透明质酸钠复合溶液中盐酸赖氨酸的检测限大于等于10-4ppm。专利技术的效果本专利技术使用透明质酸酶对供试品进行前处理，并结合液相色谱分离技术测得供试品中盐酸赖氨酸含量，方法准确度高，检测限低。按照本专利技术的方法，能够避免交联透明质酸钠对盐酸赖氨酸含量测定的干扰，提高检测准确度，降低检测限。同时又能够减少交联透明质酸钠复合溶液对色谱柱的损耗，延长色谱柱使用寿命。附图说明图1是实施例1-1中对照品色谱图。图2是实施例1-1中空白溶液的色谱图。图3是实施例1-1中供试品的色谱图。具体实施方式下面结合附图所描述的实施方式对本专利技术做以详细说明，其中所有附图中相同的数字表示相同的特征。虽然附图中显示了本专利技术的具体实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本专利技术而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本专利技术，并且能够将本专利技术的范围完整的传达给本领域的技术人员。需要说明的是，在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可以理解，技术人员可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名词的差异作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本专利技术的较佳实施方式，然而所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本专利技术的范围。本专利技术的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。所述“酶解法”是利用活性酶来水解特定的某种物质，这种方法可用于一般的生物实验中，酶(enzyme)是由活细胞产生的、对其底物具有高度特异性和高度催化效能的蛋白质或RNA。所述“外标法”是指添加一定量的标准品于空白检材中制成对照样品，与未知检材平行地进行样品处理并检测，根据对照样品响应值与其中所添加标准品浓度的函数关系推算未知检材中被测组分浓度的定量方法。本专利技术中采用的外标法没有限定，可以采用标准曲线法。注射用透明质酸钠复合溶液中加入的盐酸赖氨酸可以为合成胶原蛋白提供所需要的各类营养本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种测定注射用透明质酸钠复合溶液中盐酸赖氨酸含量的方法，其包含下述步骤：/n供试品溶液制备：利用透明质酸酶对注射用透明质酸钠复合溶液进行酶解；/n标准品溶液制备：将盐酸赖氨酸标准品溶解得到；/n检测步骤：使用高效液相色谱法，利用在线衍生技术，检测所述的供试品溶液和标准品溶液，使用外标法确定盐酸赖氨酸的含量。/n

【技术特征摘要】
1.一种测定注射用透明质酸钠复合溶液中盐酸赖氨酸含量的方法，其包含下述步骤：
供试品溶液制备：利用透明质酸酶对注射用透明质酸钠复合溶液进行酶解；
标准品溶液制备：将盐酸赖氨酸标准品溶解得到；
检测步骤：使用高效液相色谱法，利用在线衍生技术，检测所述的供试品溶液和标准品溶液，使用外标法确定盐酸赖氨酸的含量。


2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述透明质酸酶为细菌酶，优选的，在35-45℃酶解，进一步优选为42℃；优选的，酶解3-3.5h，进一步优选为2-3h；优选的，酶解pH为6.0-6.5。


3.根据权利要求1-2任一项所述的方法，其中，在线衍生技术包括下述步骤：将所述供试品溶液与衍生化试剂在缓冲溶液存在下混合，优选的，所述缓冲溶液为硼酸盐缓冲溶液。


4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述衍生化试剂为邻苯二甲醛。


5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中，在检测步骤中，使用的色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，优选为PoroshellHPH-C18色谱柱或者ZORBAEclipse-AAA色谱柱。


6.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘英，陈玉娟，陈雯雯，李芸，万金玉，沈延臻，刘建建，郭学平，
申请(专利权)人：华熙生物科技股份有限公司，山东华熙海御生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37