转甲状腺素蛋白进入眼内以及在制备滴剂中的应用制造技术

本发明专利技术提供了转甲状腺素蛋白作为蛋白质类和/或多肽类药物通过眼部屏障进入眼内的载体方面的应用，所述转甲状腺素蛋白为由SEQ ID NO:1或其突变或其修饰所示氨基酸组成的蛋白质。本发明专利技术还提供了转甲状腺素蛋白和/或转甲状腺素蛋白与药物的融合蛋白在制备滴剂中的应用以及一种滴剂，所述药物为蛋白质类和/或多肽类药物。转甲状腺素蛋白在人体内具有较好的生物相容性与安全性，能够有效地将外源蛋白和/或多肽输送到眼内，达到治疗眼部疾病的作用。通过使用滴眼的方式，在治疗DR、AMD、ROP等眼部疾病时，转甲状腺素蛋白可跨越角膜屏障进入玻璃体及眼底，显著抑制眼球视网膜渗漏，显著降低视网膜新生血管数，有效缓解眼部疾病的病理现象。

【技术实现步骤摘要】
转甲状腺素蛋白进入眼内以及在制备滴剂中的应用
本专利技术涉及医药
，具体涉及转甲状腺素蛋白作为蛋白质类和/或多肽类药物通过眼部屏障进入眼内的载体方面的应用，本专利技术还涉及转甲状腺素蛋白、和/或转甲状腺素蛋白与蛋白质类和/或多肽类药物组成的融合蛋白在制备滴剂中的应用以及一种滴剂。
技术介绍
糖尿病视网膜病变(DiabeticRetinopathy，DR)简称“糖网”，是糖尿病微血管病的临床表现，也是糖尿病最严重的并发症之一，现在已经成为主要的致盲眼病之一。主要是在眼部长期高糖及缺氧的微环境下，逐步发生微血管阻塞、微血管瘤、出血、静脉扩张、黄斑水肿、新生血管、大量玻璃体出血、眼内纤维化、视网膜脱离等临床症状。老年性黄斑变性(Age-relatedmaculardegeneration，AMD)，为黄斑区结构的衰老性改变。主要表现为视网膜色素上皮细胞对视细胞外节盘膜吞噬消化的能力下降，结果使未被完全消化的盘膜残余小体潴留于基底部细胞原浆中，并向细胞外排出，沉积于Bruch膜，形成玻璃膜疣。由于黄斑部结构与功能上的特殊性，此种改变更为明显。玻璃膜疣也见于正常视力的老年人，但由此继发的种种病理改变后，则导致黄斑部变性发生。或者引起Bruch膜断裂，脉络膜毛细血管通过破裂的Bruch膜进入RPE(retinalpigmentepithelium，视网膜色素上皮)下及视网膜神经上皮下，形成脉络膜新生血管，脉络膜新生血管为视网膜下新生血管。由于新生血管壁的结构异常，导致血管的渗漏和出血，进而引发一系列的继发性病理改变。老年性黄斑变性大多发生于45岁以上，其患病率随年龄增长而增高，是当前老年人致盲的重要疾病。早产儿视网膜病变(retinopathyofprematurity，ROP)是指在孕36周以下、低出生体重、长时间吸氧的早产儿，其未血管化的视网膜发生纤维血管瘤增生、收缩，并进一步引起牵拉性视网膜脱离和失明。以往曾称为Terry综合征或晶状体后纤维增生症，但后者仅反映了该病的晚期表现。孕期更短或更低出生体重者，发生率可达60％～80％。其病因是由于早产儿出生后在温箱内高氧环境中过度吸氧，而移出温箱后处于相对缺氧的状态，未完全血管化的视网膜对氧产生血管收缩和血管增殖。针对眼部疾病的治疗，需要将药物有效的传递到眼内，特别是上述糖尿病视网膜病变、老年性黄斑变性以及早产儿视网膜病变等眼部疾病；但由于眼部存在较多的屏障，将药物有效的传递到眼内充满了挑战性。因此，近来眼部给药系统受到了广泛的关注。根据眼部解剖结构，眼部屏障主要包括了泪液屏障、角膜/结膜屏障、以及血眼屏障；多重屏障在保护眼部的同时，能够有效的阻挡外源化学及生物分子的侵入，但也给药物的传递带来了较大的阻碍。目前，眼部常用的给药方式主要包括常规滴眼、结膜下注射及巩膜给药，以及玻璃体内注射给药。其中，常规滴眼液与眼表接触时间较短，由于自身的结构与特性，一些外源药物及蛋白很难有效进入眼内；而结膜下注射及玻璃体内注射通常会带来一定程度的创伤。视网膜激光治疗、玻璃体切除联合硅油填充术这些方法损伤较大，视力恢复不理想。目前治疗DR、AMD以及ROP的最常规手段为玻璃体腔内注射抗vegf抗体，但这种方式通常会带来一定程度的创伤，多次给药必须有较长时间的间隔期。目前，也有一些专利文献设计了能够有效突破各种眼部屏障到达眼内的功能性小肽，如郑颖，许讯等人的专利(一类新的抑制新生血管的小肽及其应用，CN2013100527142)，苏莉等人的专利(一类抑制新生血管的小肽及其应用，CN201310058978.9)，杨晓璐等人的专利(一种预防和/或治疗炎症反应的小分子多肽及其应用)。以上研究均存在一定的局限性，眼内注射会带来一定的创伤，而功能性小肽的输送效率较低半衰期较短，为此，有必要寻找更为安全稳定、有效且对眼部无伤害或伤害较小的药物及给药方法。
技术实现思路
本专利技术为了克服现有技术中由于眼部屏障的存在而没有能够安全稳定、有效且对眼部无伤害或伤害较小的将药物传递至眼内的给药方法和药物以治疗糖尿病视网膜病变(DR)、老年性黄斑变性(AMD)、早产儿视网膜病变(ROP)等眼部疾病的缺陷，提供了一种转甲状腺素蛋白(TTR)作为蛋白质类和/或多肽类药物通过眼部屏障进入眼内的载体方面的应用，一种转甲状腺素蛋白、和/或转甲状腺素蛋白与蛋白质类和/或多肽类药物组成的融合蛋白在制备滴剂中的应用以及一种滴剂。本专利技术人通过大量实验，意外发现通过使用滴剂进行滴眼而非本领域常规的进行注射的方式，转甲状腺素蛋白可有效跨越角膜屏障进入玻璃体及眼底，并且还能有效地输送外源蛋白和/或多肽，由此，可以根据眼部疾病的病理特征，选择合适的蛋白质类和/或多肽类药物，通过转甲状腺素蛋白输送至眼内，从而达到治疗眼部疾病的作用，在医药领域作为注射类药物的替代物方面具有重要的应用前景。本专利技术人通过大量实验，还意外地发现在转甲状腺素蛋白跨越角膜屏障进入玻璃体及眼底之后，转甲状腺素蛋白可以显著抑制眼球视网膜渗漏，显著降低视网膜新生血管数，有效缓解DR、AMD、ROP等眼部疾病。即，无需与蛋白质类和/或多肽类药物融合，转甲状腺素蛋白本身即可治疗或缓解DR、AMD、ROP等眼部疾病，并且能够达到足够的治疗浓度和治疗时间(半衰期很长)。而且，本领域技术人员仅知晓透明质酸具有湿润的作用，并不知晓其可以增加转甲状腺素蛋白的透过量，而本专利技术人还进一步发现在制备滴剂例如滴眼液时，使用透明质酸可以增加玻璃体腔内及眼底转甲状腺素蛋白的透过量，进而有效增加转甲状腺素蛋白的浓度。为了解决上述技术问题，本专利技术第一方面提供了转甲状腺素蛋白作为蛋白质类和/或多肽类药物通过眼部屏障进入眼内的载体方面的应用，所述转甲状腺素蛋白如(a)、(b)或(c)所示：(a)由SEQIDNO:1所示氨基酸组成的蛋白质；(b)在(a)中的氨基酸序列上经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸的序列所示的具有抑制血管新生功能的由(a)衍生的蛋白质；(c)在(a)或(b)中的氨基酸序列上经过亲水性修饰或疏水性修饰的序列所示的蛋白质。较佳地，所述(b)中，所述的由(a)衍生的蛋白质为在(a)中的氨基酸序列上经过22个氨基酸的取代。较佳地，所述(b)中，所述的由(a)衍生的蛋白质为在(a)中的氨基酸序列上经过25个氨基酸的取代。较佳地，所述(b)中，所述的由(a)衍生的蛋白质为在(a)中的氨基酸序列的T3、T5、I26、N27、H31、R34、A36、A37、D38、D39、T40、S50、E61、E63、V65、I68、K70、I73、A81、H90、E92、P102、R104、T123、K126和/或E127发生取代。更佳地，所述(b)中，所述的由(a)衍生的蛋白质为在(a)中的氨基酸序列上经过T3G、T5A、I26V、N27D、H31K、R34K、A36T、D39G、T40S、S50A、E61D、E63K、V65T、I68V、K70R、I73L、H90Y、P102H、R104H、T123S、K本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.转甲状腺素蛋白作为蛋白质类和/或多肽类药物通过眼部屏障进入眼内的载体方面的应用，所述转甲状腺素蛋白如(a)、(b)或(c)所示：/n(a)由SEQ ID NO:1所示氨基酸组成的蛋白质；/n(b)在(a)中的氨基酸序列上经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸的序列所示的具有抑制血管新生功能的由(a)衍生的蛋白质；/n(c)在(a)或(b)中的氨基酸序列上经过亲水性修饰或疏水性修饰的序列所示的蛋白质。/n

【技术特征摘要】
20191217 CN 20191130293731.转甲状腺素蛋白作为蛋白质类和/或多肽类药物通过眼部屏障进入眼内的载体方面的应用，所述转甲状腺素蛋白如(a)、(b)或(c)所示：
(a)由SEQIDNO:1所示氨基酸组成的蛋白质；
(b)在(a)中的氨基酸序列上经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸的序列所示的具有抑制血管新生功能的由(a)衍生的蛋白质；
(c)在(a)或(b)中的氨基酸序列上经过亲水性修饰或疏水性修饰的序列所示的蛋白质。


2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述(b)中，所述的由(a)衍生的蛋白质为在(a)中的氨基酸序列上经过22个氨基酸的取代、25个氨基酸的取代、或5个氨基酸的缺失；
和/或，所述(c)中，所述亲水性修饰或疏水性修饰在(a)中的氨基酸序列上的第10位的半胱氨酸上进行；
较佳地：
所述(b)中，所述的由(a)衍生的蛋白质为在(a)中的氨基酸序列的T3、T5、I26、N27、H31、R34、A36、A37、D38、D39、T40、S50、E61、E63、V65、I68、K70、I73、A81、H90、E92、P102、R104、T123、K126和/或E127发生取代；或在(a)中的氨基酸序列的第123-127位发生缺失；优选在(a)中的氨基酸序列上经过T3G、T5A、I26V、N27D、H31K、R34K、A36T、D39G、T40S、S50A、E61D、E63K、V65T、I68V、K70R、I73L、H90Y、P102H、R104H、T123S、K126Q和E127N的取代，或在(a)中的氨基酸序列上经过T3G、T5A、I26V、N27D、H31K、R34K、A36T、A37S、D38E、D39G、T40S、S50A、E61D、E63K、I68V、K70R、I73L、A81T、H90F、E92D、P102H、R104H、T123S、K126Q和E127N的取代；
和/或，所述(c)中，所述蛋白质为在(a)中的氨基酸序列上的第10位的半胱氨酸上使用长链疏水片段例如正十二烷进行修饰；
更佳地：
所述(b)中，所述的由(a)衍生的蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO:9、SEQIDNO:10或SEQIDNO:11所示；
和/或，所述(c)中，所述蛋白质为在(a)中的氨基酸序列上的第10位的半胱氨酸上通过马来酰亚胺连接正十二烷修饰的序列所示的蛋白质。


3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述转甲状腺素蛋白与所述蛋白质类和/或多肽类药物融合表达；所述融合优选是将所述蛋白质类和/或多肽类药物融合在所述转甲状腺素蛋白的N端或C端；所述转甲状腺素蛋白与所述蛋白质类和/或多肽类药物融合优选是在微生物细胞中表达，并经过纯化；所述纯化优选是通过内毒素吸附柱去除内毒素，再通过0.22μm孔径滤膜去除残留菌体；
和/或，所述蛋白质类和/或多肽类药物包括溶菌酶、白蛋白和/或EGFR抗体，且分子量不超过45kDa；所述溶菌酶优选为鸡蛋清溶菌酶，其GenBank登录号为AAL69327.1；所述白蛋白优选为鸡蛋清白蛋白；
和/或，所述蛋白质类和/或多肽类药物包括治疗糖尿病视网膜病变、老年性黄斑变性和/或早产儿视网膜病变的蛋白质类和/或多肽类药物。


4.如权利要求1～3任一项所述的应用，其特征在于，编码所述转甲状腺素蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示；
和/或，所述转甲状腺素蛋白通过使用重组表达载体进行表达，所述重组表达载体的骨架质粒中的启动子为鼠李唐诱导型启动子，优选为rhaPBAD启动子；
和/或，所述转甲状腺素蛋白通过使用重组表达载体进行表达，所述重组表达载体的骨架载体为pET-21a或与其具有25％及以上同源性的载体，所述与其具有25％及以上同源性的载体的序列优选如SEQIDNO:8所示；
和/或，表达所述转甲状腺素蛋白的重组质粒的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示；
和/或，所述转甲状腺素蛋白是在微生物细胞中表达，并优选经过纯化；所述的微生物细胞优选为大肠杆菌，所述大肠杆菌优选包括E.coliBL21、E.coliBL21(DE3)、E.coliJM109、E.coliDH5α、E.coliK12；所述纯化优选是通过内毒素吸附柱去除内毒素，通过0.22μm孔径滤膜去除残留菌体；
和/或，表达所述转甲状腺素蛋白时，通过培养包含所述转甲状腺素蛋白的基因的转化体至所得菌体的OD600达到1.5-2.0，例如1.6、1.7、1.8或1.9时进行表达；
和/或，表达所述转甲状腺素蛋白时为使用诱导表达的试剂进行诱导表达，所述诱导表达的试剂的质量体积百分比为0.1-2％，例如0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.7％、0.8％、1.2％或1.6％，所述诱导表达的时间优选为8-20h，例如10h、12h、14h、16h、17h、18h或19h；所述诱导表达的试剂优选为鼠李糖或者IPTG。


5.转甲状腺素蛋白和/或转甲状腺素蛋白与药物组成的融合蛋白在制备滴剂中的应用，所述药物为蛋白质类和/或多肽类药物，所述转甲状腺素蛋白如(a)、(b)或(c)所示：
(a)由SEQIDNO:1所示氨基酸组成的蛋白质；
(b)在(a)中的氨基酸序列上经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸的序列所示的具有抑制血管新生功能的由(a)衍生的蛋白质；
(c)在(a)或(b)中的氨基酸序列上经过亲水性修饰或疏水性修饰的序列所示的蛋白质。


6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述(b)中，所述的由(a)衍生的蛋白质为在(a)中的氨基酸序列上经过22个氨基酸的取代、25个氨基酸的取代、或5个氨基酸的缺失；
和/或，所述(c)中，所述亲水性修饰或疏水性修饰在(a)中的氨基酸序列上的第10位的半胱氨酸上进行；
较佳地：
所述(b)中，所述的由(a)衍生的蛋白质为在(a)中的氨基酸序列的T3、T5、I26、N27、H31、R34、A36、A37、D38、D39、T40、S50、E61、E63、V65、I68、K70、I73、A81、H90、E92、P102、R104、T123、K126和/或E127发生取代；或在(a)中的氨基酸序列的第123-127位发生缺失；优选在(a)中的氨基酸序列上经过T3G、T5A、I26V、N27D、H31K、R34K、A36T、D39G、T40S、S50A、E61D、E63K、V65T、I68V、K70R、I73L、H90Y、P102H、R104H、T123S、K126Q和E127N的取代，或在(a)中的氨基酸序列上经过T3G、T5A、I26V、N27D、H31K、R34K、A36T、A37S、D38E、D39G、T40S、S50A、E61D、E63K、I68V、K70R、I73L、A81T、H90F、E92D、P102H、R104H、T123S、K126Q和E127N的取代；
和/或，所述(c)中，所述蛋白质为在(a)中的氨基酸序列上的第10位的半胱氨酸上使用长链疏水片段例如正十二烷进行修饰；
更佳地：
所述(b)中，所述的由(a)衍生的蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO:9、SEQIDNO:10或SEQIDNO:11所示；
和/或，所述(c)中，所述蛋白质为在(a)中的氨基酸序列上的第10位的半胱氨酸上通过马来酰亚胺连接正十二烷修饰的序列所示的蛋白质。


7.如权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述融合蛋白的含量≥4μmol/L，优选10-15μmol/L；
和/或，所述转甲状腺素蛋白的含量为≥4μmol/L，优选5-30μmol/L，更优选10-20μmol/L，例如15、20、25μmol/L；
和/或，所述滴剂中还含有生理盐水；
和/或，所述滴剂中还含有透明质酸，所述透明质酸的含量≤6％，优选1-4％，更优选2％；
和/或，所述滴剂优选滴眼液；
和/或，所述滴剂优选为治疗糖尿病视网膜病变、老年性黄斑变性和/或早产儿视网膜病变的滴剂；
和/或，所述滴剂以每日滴加1-3次、每次滴加量优选为0.6-0.8nmol蛋白/眼进行施用；
和/或，所述滴剂以每日2次、每次1滴、持续3个月进行施用；和/或，所述滴剂以每日2次、每次1滴、持续5天进行施用；和/或，所述滴剂以每日2次、每次1滴、持续3周进行施用；
和/或，编码所...

【专利技术属性】
技术研发人员：辛瑜，
申请(专利权)人：童妍上海医疗器械有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31