【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用以分离外泌体的胎盘培养本申请要求2018年11月16日提交的美国临时专利申请号62/587,335的权益，所述临时专利申请的公开内容以引用的方式整体并入本文。
提供了用以从培养的胎盘或其部分产生、分离外泌体以及表征所述外泌体的方法。本文所述的替代方案有助于外泌体的所述产生、分离和表征，所述外泌体能够用作生物技术工具和治疗剂。
技术介绍
外泌体是从活细胞分泌的纳米级双脂质膜囊泡，所述外泌体在细胞间通讯中起重要作用。在人类怀孕期间，胎盘在调控生理稳态和支持胎儿发育中起着核心作用。已知由胎盘分泌的细胞外囊泡和外泌体有助于胎盘与母体组织之间的通讯，以维持母胎耐受性。外泌体含有活性生物制剂，包括可呈递在外泌体表面上的脂质、细胞因子、微小RNA、mRNA和DNA以及蛋白质。外泌体被认为可用于许多治疗方法，包括免疫调节、促进血管生成和用于递送药物。显然需要允许分离大量外泌体的更多方法。
技术实现思路
本专利技术的方面涉及用以从培养的胎盘或其部分产生、分离外泌体以及表征所述外泌体的方法。本文所述的方法有助于外泌体的所述产生、分离和表征，所述外泌体能够用作生物技术工具和治疗剂。优选的替代方案包括：1.一种从胎盘或其部分中分离外泌体的方法，所述方法包括：a)使胎盘或其部分，优选地是培养的胎盘或其部分与第一培养基接触；以及b)从所述胎盘或其部分获得包含外泌体群体的第一级分；c)任选地，使所述胎盘或其部分与第二培养基接触，并从所述胎盘或其部分获得包含外泌体群体的第二级分；...
【技术保护点】
1.一种从胎盘或其部分中分离外泌体的方法，所述方法包括：/na)使胎盘或其部分，优选地是培养的胎盘或其部分与第一培养基接触；以及/nb)从所述胎盘或其部分获得包含外泌体群体的第一级分；/nc)任选地，使所述胎盘或其部分与第二培养基接触，并从所述胎盘或其部分获得包含外泌体群体的第二级分；/nd)任选地，使所述胎盘或其部分与第三培养基接触，并从所述胎盘或其部分获得包含外泌体群体的第三级分；以及/ne)任选地，优选地通过连续离心和/或亲和色谱法，使用对所需的外泌体群体上存在的标志物或肽具有特异性的抗体或其结合部分，从所述第一级分、所述第二级分和/或所述第三级分中分离所述外泌体群体，其中所述抗体或其结合部分被固定在诸如膜、树脂、珠粒或器皿的基底上。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171116 US 62/587,3351.一种从胎盘或其部分中分离外泌体的方法，所述方法包括：
a)使胎盘或其部分，优选地是培养的胎盘或其部分与第一培养基接触；以及
b)从所述胎盘或其部分获得包含外泌体群体的第一级分；
c)任选地，使所述胎盘或其部分与第二培养基接触，并从所述胎盘或其部分获得包含外泌体群体的第二级分；
d)任选地，使所述胎盘或其部分与第三培养基接触，并从所述胎盘或其部分获得包含外泌体群体的第三级分；以及
e)任选地，优选地通过连续离心和/或亲和色谱法，使用对所需的外泌体群体上存在的标志物或肽具有特异性的抗体或其结合部分，从所述第一级分、所述第二级分和/或所述第三级分中分离所述外泌体群体，其中所述抗体或其结合部分被固定在诸如膜、树脂、珠粒或器皿的基底上。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述胎盘或其部分还包括羊膜。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述胎盘或其部分是人胎盘或其部分。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一培养基、所述第二培养基和/或所述第三培养基与所述胎盘或其部分接触至少45分钟，如45分钟或1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时或24小时或2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天或20天或在由前述时间点中的任何两者限定的范围内的任何时间量。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一培养基、所述第二培养基和/或所述第三培养基与所述胎盘或其部分接触至少7天、14天、28天、35天或42天或在由前述时间点中的任何两者限定的范围内的任何时间量。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中已将所述胎盘或其部分切碎、研磨或进行酶处理。
7.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述胎盘或其部分是基本上平坦的或片状的，并且已经脱细胞且基本上干燥，并且其中所述方法还包括使包含外源细胞的流体与所述脱细胞的胎盘或其部分接触，以便使所述脱细胞的胎盘或其部分接种所述外源细胞，并且其中所述细胞与所述脱细胞的胎盘或其部分的所述接触已在使所述脱细胞的胎盘或其部分与第一培养基接触之前进行。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述外源细胞从与所述胎盘或其部分的供体受试者不同的受试者获得。
9.如权利要求7或8所述的方法，其中所述流体包括腹水、血液或血浆。
10.如权利要求7或8所述的方法，其中所述细胞来自器官。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述细胞来自肝、肾、肺或胰腺。
12.如权利要求7或8所述的方法，其中所述细胞是免疫细胞。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述细胞是T细胞或B细胞。
14.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一培养基包含磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
15.如权利要求9所述的方法，其中所述第一级分、所述第二级分或所述第三级分包含来自腹水、血液或血浆的外泌体。
16.如权利要求10所述的方法，其中所述第一级分、所述第二级分或所述第三级分包含来自器官细胞的外泌体。
17.如权利要求11所述的方法，其中所述细胞来自肝、肾、肺或胰腺。
18.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二培养基包含生长因子。
19.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第三培养基包含螯合剂。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述螯合剂是膦酸酯、BAPTA四钠盐、BAPTA/AM、二-NotrophenTM试剂四钠盐、EGTA/AM、吡哆醛异烟酰肼、N,N,N′,N′-四-(2吡啶基甲基)乙二胺、6-溴-N′-(2-羟基亚苄基)-2-甲基喹啉-4-碳酰肼、1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N′,N′-四乙酸四(乙酰氧基甲基酯)、(亚乙基二次氮基)四乙酸(EDTA)、Edathamil、亚乙基二次氮基四乙酸、乙二醇-双(2-氨基乙基醚)-N,N,N′,N′-四乙酸或乙二醇-双(β-氨基乙基醚)-N,N,N′,N′-四乙酸四钠盐(EGTA)或它们的任何组合。
21.如权利要求19或20中任一项所述的方法，其中所述螯合剂是EDTA或EGTA或它们的组合。
22.如权利要求19-21中任一项所述的方法，其中所述螯合剂以1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM或100mM的浓度或以在由前述浓度中的任何两者限定的范围内的浓度提供于所述第三培养基中。
23.如权利要求19-22中任一项所述的方法，其中所述第三培养基中的EDTA的浓度以1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM或100mM的浓度或以在由前述浓度中的任何两者限定的范围内的浓度提供。
24.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第三培养基包含蛋白酶。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述蛋白酶是胰蛋白酶、胶原酶、胰凝乳蛋白酶或羧肽酶或它们的任何组合。
26.如权利要求25或25所述的方法，其中所述蛋白酶是胰蛋白酶。
27.如权利要求24所述的方法，其中所述蛋白酶以1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM或100mM的浓度或以在由前述浓度中的任何两者限定的范围内的浓度提供于所述第三培养基中。
28.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括使所述胎盘或其部分与另外的多种培养基接触，其中所述接触导致获得包含外泌体的多个级分。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述第一培养基、所述第二培养基、所述第三培养基或所述另外的培养基包含葡萄糖。
30.如权利要求28或29所述的方法，其中所述第一培养基、所述第二培养基、所述第三培养基或所述另外的培养基包含GM-CSF。
31.如权利要求28-30中任一项所述的方法，其中所述第一培养基、所述第二培养基、所述第三培养基或所述另外的培养基包含血清。
32.如权利要求28-31中任一项所述的方法，其中所述第一培养基、所述第二培养基、所述第三培养基或所述另外的培养基包含DMEM。
33.如权利要求28-32中任一项所述的方法，其中所述第一培养基、所述第二培养基、所述第三培养基或所述另外的培养基包含AHR拮抗剂。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述AHR拮抗剂是SR1。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述SR1的浓度为1nM、10nM、100nM、200nM、300nM、400nM、500nM、600nM、700nM、800nM、900nM或1mM，或在由前述值中的任何两者限定的范围内的任何其他浓度。
36.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中使所述第一培养基与所述胎盘或其部分接触，同时维持0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃或40℃的温度或在由前述温度中的任何两者限定的范围内的温度。
37.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中使所述第二培养基与所述胎盘或其部分接触，同时维持0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃或40℃的温度或在由前述温度中的任何两者限定的范围内的温度。
38.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中使所述第三培养基与所述胎盘或其部分接触，同时维持0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃或40℃的温度或在由前述值中的任何两者限定的范围内的温度。
39.如权利要求28-38中任一项所述的方法，其中使所述另外的多种培养基与所述胎盘或其部分接触，同时维持0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃或40℃的温度或在由前述值中的任何两者限定的范围内的温度。
40.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一灌注、所述第二灌注或所述第三灌注或所述另外的多种培养基包含抗生素。<...
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