一种胶体金试纸及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供一种胶体金试纸及其制备方法和应用，涉及医用检测器械领域。该制备方法，包括以下步骤：制备抗原：采用293T细胞表达重组抗原RBD，重组抗原RBD氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；制备抗原膜：用包被缓冲液包被抗原，在封闭液中浸泡，烘干；制备金标抗体：配制氯金酸溶液，加入柠檬酸三钠溶液，加热至液体呈亮红色，调节pH至7.3‑7.8，加入抗体，混匀，离心，清洗沉淀，用金标抗体保存液溶解；冻干：将金标抗体铺在玻璃纤维膜上，冷冻干燥；制备试纸板：将抗原膜、吸水纸、冻干金标抗体玻璃纤维膜贴在塑料底板上，即得胶体金试纸。本发明专利技术针对2019‑nCoV新型冠状病毒的特异性片段，得到重组抗原RBD，应用于胶体金试纸，可以降低检测假阳性，提高检测准确度和效率。

【技术实现步骤摘要】
一种胶体金试纸及其制备方法和应用
本专利技术涉及医用检测器械领域，特别是涉及一种胶体金试纸及其制备方法和应用。
技术介绍
2020年2月11日，国际病毒分类委员会(InternationalCommitteeonTaxonomyofViruses，ICTV)宣布新型冠状病毒的正式名称：严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severeacuterespiratorysyndromecoronavirus2，2019-nCoV)。当日，世界卫生组织(WHO)总干事谭德赛宣布，新型冠状病毒感染的肺炎将正式被命名为“COVID-19”。目前对新冠病毒仍然没有特效药和疫苗，最有效的方法是隔离和监测。而新冠病毒目前临床上以核酸检测为金标准，然而，由于采样部位和操作手法的差异，常常出现漏检的情况发生，临床上亟需有其他有效的检测方法作为辅助检测方法。此外，对一些流动人群聚集地，使用核酸检测这种需要依赖大型机器的方法并不现实。对患者血清中针对新冠病毒抗原的IgM和IgG检测是一种可靠的方法。而使用胶体金标法则因为其简便快速，不需要机器，适合大规模筛查，是检测新冠病毒诱导产生的IgM和IgG的有力工具。目前，国内的新冠病毒胶体金仍然没有成熟的产品上市，前期的产品也出现了假阳性过高的情况，其原因之一是抗原的选择方面有差异，因为人们容易认为使用全长抗原更加精准，却忽视了全长抗原容易产生交叉反应。2019-nCoV具有棘突蛋白S,基质蛋白M,包膜蛋白E和核蛋白N等数种结构蛋白。目前常用于做检测试剂的是S抗原，然而，业内反映使用全长的S抗原容易产生假阳性。因此，筛选更合适的抗原制备胶体金检测卡，是目前胶体金检测卡需要解决的重要问题。
技术实现思路
基于此，有必要针对上述问题，提供一种胶体金试纸的制备方法，针对新型冠状病毒的特异性片段，得到S蛋白的RBD片段，有利于降低检测假阳性，提高检测准确度和效率。一种胶体金试纸的制备方法，包括以下步骤：制备抗原：采用293T细胞表达2019-nCoV的S蛋白上的RBD抗原片段，分离纯化，得到重组RBD抗原，所述重组抗原RBD氨基酸序列如SEQIDNo.1所示；制备抗原膜：用包被缓冲液包被抗原，在封闭液中浸泡，烘干，取出备用；制备金标抗体：配制氯金酸溶液，加热，加入柠檬酸三钠溶液，继续加热至液体呈亮红色，停止加热，得到胶体金，调节胶体金pH至7.3-7.8，加入2019-nCoV抗体，混匀，离心，弃掉上清液，清洗沉淀，用金标抗体保存液溶解，备用；冻干：将金标抗体铺在玻璃纤维膜上，冷冻干燥，得到冻干金标抗体玻璃纤维膜；制备试纸板：裁切金标抗体玻璃纤维膜，将抗原膜、吸水纸、冻干金标抗体玻璃纤维膜贴在塑料底板上，即得胶体金试纸。SEQIDNo.1：RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFADDDDKAVPRDSGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK上述制备方法，针对2019-nCoV新型冠状病毒的特异性片段，选取的片段是新冠病毒S蛋白的“受体结合结构域”蛋白(RBD)，即S蛋白与ACE2相联结的地方，是决定新冠病毒感染能力的重要片段，研究结果表明新冠病毒S蛋白以三聚体形态存在，每一个单体中约有1300多个氨基酸，其中300多个氨基酸构成了“受体结合结构域”(RBD)，空间结构也是决定抗原特异性的重要指标，基于此，本专利技术得到得到S蛋白的RBD片段，作为抗原的诊断试剂，用该重组抗原制备得到的胶体金试纸，可以降低检测假阳性，提高检测准确度和效率。在其中一个实施例中，所述制备抗原步骤具体为：筛选2019-nCoV的S抗原的RBD片段基因，将RBD片段基因与载体连接，导入293T细胞中，培养293T细胞，表达重组抗原RBD，收集培养上清液，分离纯化，获得重组抗原RBD。可以理解地，S蛋白的RBD片段核苷酸序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一旦获得了目标序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列，即将其克隆入载体，再转入宿主细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。在其中一个实施例中，所述载体选用质粒或病毒颗粒。可以完全通过化学合成来得到编码本专利技术蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列，然后可将该DNA序列引入已知的载体和细胞中。表达载体中的多核苷酸序列可以可操作地和表达控制序列连接，还包含用于翻译起始和转录终止的核糖体结合位点，优选的包含一个或多个选择性标记。载体可以通过转化、转导、转染等方式进入宿主细胞。宿主细胞经过本领域所熟知的方法培养一段时间，用常规方法如物理或化学方法收集上清并纯化抗原蛋白。本专利技术还提供一种由上述方法制备得到的胶体金试纸。该试纸可以高效、快速、准确地检测2019-nCoV。本专利技术还提供一种新型冠状病毒的胶体金试纸检测卡，包括：底座，设有安装槽，所述安装槽的长度方向沿所述底座的长度方向延伸；盖体，覆盖在所述底座上，所述盖体包括透明的观察窗、加样孔和加样盖，所述加样盖连接于所述盖体，用于嵌入所述加样孔内以封闭所述加样孔；上述胶体金试纸，设于所述安装槽内并且所述观察窗的下方，所述胶体金试纸的检测区位于所述加样孔的下方，在血清经所述加样孔滴入所述检测区后，通过所述观察窗观察所述胶体金试纸的检测结果。上述新型冠状病毒的胶体金试纸检测卡，一方面采用上述胶体金试纸，有利于提高检测效率和准确性，另一方面，将胶体金试纸设置在盖体内处于密闭状态下，在测试时通过加样孔滴入血清，使得血清能够在密闭的环境下被检测，通过观察窗来观察检测结果，从而可以降低气溶胶传播能力，降低新冠病毒在检测时的传染风险。在其中一个实施例中，所述底座还包括若干卡座，所述卡座设于所述安装槽附近，用于卡持所述胶体金试纸。在其中一个实施例中，所述底座还包括导向部，设于所述安装槽的端部，用于引导所述胶体金试纸移动至所述安装槽内。在其中一个实施例中，述盖体还包括与所述安装槽对应的档门，所述档门铰接于所述盖体，在所述胶体金试纸转动所述档门进入所述安装本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种胶体金试纸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/n制备抗原：采用293T细胞表达2019-nCoV的S蛋白上的RBD抗原片段，分离纯化，得到重组抗原RBD，所述重组抗原RBD氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；/n制备抗原膜：用包被缓冲液包被抗原，在封闭液中浸泡，烘干，取出备用；/n制备金标抗体：配制氯金酸溶液，加热，加入柠檬酸三钠溶液，继续加热至液体呈亮红色，停止加热，得到胶体金，调节胶体金pH至7.3-7.8，加入2019-nCoV抗体，混匀，离心，弃掉上清液，清洗沉淀，用金标抗体保存液溶解，备用；/n冻干：将胶金标抗体铺在玻璃纤维膜上，冷冻干燥，得到冻干金标抗体玻璃纤维膜；/n制备试纸板：裁切金标抗体玻璃纤维膜，将抗原膜、吸水纸、冻干金标抗体玻璃纤维膜贴在塑料底板上，即得胶体金试纸。/n

【技术特征摘要】
1.一种胶体金试纸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
制备抗原：采用293T细胞表达2019-nCoV的S蛋白上的RBD抗原片段，分离纯化，得到重组抗原RBD，所述重组抗原RBD氨基酸序列如SEQIDNo.1所示；
制备抗原膜：用包被缓冲液包被抗原，在封闭液中浸泡，烘干，取出备用；
制备金标抗体：配制氯金酸溶液，加热，加入柠檬酸三钠溶液，继续加热至液体呈亮红色，停止加热，得到胶体金，调节胶体金pH至7.3-7.8，加入2019-nCoV抗体，混匀，离心，弃掉上清液，清洗沉淀，用金标抗体保存液溶解，备用；
冻干：将胶金标抗体铺在玻璃纤维膜上，冷冻干燥，得到冻干金标抗体玻璃纤维膜；
制备试纸板：裁切金标抗体玻璃纤维膜，将抗原膜、吸水纸、冻干金标抗体玻璃纤维膜贴在塑料底板上，即得胶体金试纸。


2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备抗原步骤具体为：筛选2019-nCoV的S抗原的RBD片段基因，将RBD片段基因与载体连接，导入293T细胞中，培养293T细胞，表达重组抗原RBD，收集培养上清液，分离纯化，获得重组抗原RBD。


3.一种如权利要求1或2所述的制备方法得到的胶体金试纸。


4.一种新型冠状病毒的胶体金试纸检测卡，其特征在于，包括：
底座，设有安装槽，所述安装槽的长度方向沿所述底座的长度方向延伸；
盖体，覆盖在所述底座上，所述盖体包括透明的观察窗、加样孔和加样盖...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡祥胜，项磊，马兴标，杨小蓉，陈兴露，陈三三，卢汉威，
申请(专利权)人：广东药科大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：广东;44