【技术实现步骤摘要】
一种利用ARTP与紫外复合诱变的绿僵菌菌株制备方法
本专利技术涉及真菌
，具体为一种利用ARTP与紫外复合诱变的绿僵菌菌株制备方法。
技术介绍
金龟子绿僵菌(Metarhiziumanisopliae)是一种广谱的昆虫病原真菌，具有不污染环境、无残留、害虫不会产生抗药性，对人畜无害等优点，被认为是一种环境友好型杀虫剂。金龟子绿僵菌致病机理是由其分生孢子粘附在昆虫体表，利用氨基酸、蛋白质等营养物质萌发，分泌蛋白酶，几丁质酶等穿透昆虫表皮，在昆虫体内大量繁殖，产生毒素，最后导致昆虫死亡。但是不利的环境条件会影响微生物制剂的发挥，紫外线、湿度和温度都是影响绿僵菌分生孢子萌发和生长的因素。在田间试验中，紫外线和高温降低了孢子的存活率，毒力大大降低，阻碍了绿僵菌分生孢子的作用。若是能够提高绿僵菌的产孢量，紫外抗性等性能，将有助于保持分生孢子的活力，萌发能力和毒力，提高绿僵菌的应用能力。常压室温等离子体诱变系统(ARTP)，一种新兴的诱变技术，它能够产生具有高活性粒子浓度的等离子体射流，引起生物体的死亡或突变，从而引起基因...
【技术保护点】
1.一种利用ARTP与紫外复合诱变的绿僵菌菌株制备方法，其特征在于：包括以下步骤：/nS1、制备孢悬液：取Tween80溶液5mL打在新鲜的培养基平板上，将原始绿僵菌菌株的孢子冲洗下来放入到10mL含有玻璃珠的离心管中，并振荡均匀，用四层的灭菌擦镜纸过滤后稀释相应的倍数；/nS2、ARTP诱变：将载片放于酒精灯外焰灼烧30s，放到已灭过菌的平板中，待冷却后，取10μL菌液均匀涂于载片上，打开ARTP诱变育种仪，开启紫外灯灭菌30min，将盛有990μL无菌水的1.5mL EP管固定在ARTP诱变仪卡槽里，把装有载片的灭菌培养皿转移到ARTP操作室内，用无菌镊子依次将载片放到...
【技术特征摘要】 【专利技术属性】
1.一种利用ARTP与紫外复合诱变的绿僵菌菌株制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、制备孢悬液：取Tween80溶液5mL打在新鲜的培养基平板上，将原始绿僵菌菌株的孢子冲洗下来放入到10mL含有玻璃珠的离心管中，并振荡均匀，用四层的灭菌擦镜纸过滤后稀释相应的倍数；
S2、ARTP诱变：将载片放于酒精灯外焰灼烧30s，放到已灭过菌的平板中，待冷却后，取10μL菌液均匀涂于载片上，打开ARTP诱变育种仪，开启紫外灯灭菌30min，将盛有990μL无菌水的1.5mLEP管固定在ARTP诱变仪卡槽里，把装有载片的灭菌培养皿转移到ARTP操作室内，用无菌镊子依次将载片放到对应卡槽，设置ARTP诱变时间；
S3、ARTP诱变培养：在经过步骤S2的ARTP诱变后，将装有载片的EP管振荡洗脱，稀释相应地倍数并吸取100μL涂布于培养基平板中，避光培养，计算ARTP诱变致死率；
S4、紫外诱变：将磁力搅拌器放入超净工作台中，用酒精清洗超净工作台和磁力搅拌器，固定距离30cm，打开紫外灯灭菌20min，吸取5mL孢悬液加入于已灭菌的带有转子的平板中，打开磁力搅拌器和培养皿盖，在黑暗条件下用紫外灯照射，设置紫外诱变时间，照射结束后，关闭紫外灯；
S5、紫外诱变培养：将步骤S4中不同照射时间的菌液稀释合适的倍数，吸取100μL涂布于培养基平板中，避光培养，计算紫外诱变致死率；
S6、ARTP结合紫外复合诱变：将孢悬液依次经过步骤S2的ARTP诱变和S4的紫外诱变；
S7、ARTP结合紫外复合诱变培养：将经过步骤S6后的孢悬液稀释并涂布于培养基平板上，重复3次，避光培养，计算ARTP结合紫外复合诱变致死率；
S8、初筛：对于S7中的诱变株，观察其在不同时间的培养基平板的生长情况，计数培养基平板上的菌落，对诱变株进行初筛，将培养基平板上长出来的菌落点种于新的培养基平板上，于第6天时测量并记录菌落生长直径，筛选诱变后能产孢、菌落生长速度快、生长直径大的诱变株；
S9、复筛：包括抗紫外线能力筛选和毒力筛选，
所述抗紫外线能力筛选方法为：将初筛得到的菌株在紫外灯下照射5min，选择萌发率高的，抗紫外能力较强的菌株；
所述毒力筛选方法为：把原始菌株和通过抗紫外线能力筛选后得到的诱变株一起进行小菜蛾毒力试验，选择对小菜蛾毒力强的菌株；
技术研发人员：张国强，尼玛扎西，黄玉，
申请(专利权)人：安徽工程大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34
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