氰基亚胺噻唑烷呋喃甲酰胺类化合物在制备β-葡萄糖醛酸苷酶抑制剂中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种氰基亚胺噻唑烷呋喃甲酰胺类化合物在制备β‑葡萄糖醛酸苷酶抑制剂中的应用，本发明专利技术氰基亚胺噻唑烷呋喃甲酰胺类化合物对大肠杆菌β‑葡萄糖醛酸苷酶(EcGUS)抑制活性十分显著，IC

【技术实现步骤摘要】
氰基亚胺噻唑烷呋喃甲酰胺类化合物在制备β-葡萄糖醛酸苷酶抑制剂中的应用(一)
本专利技术涉及一类氰基亚胺噻唑烷呋喃甲酰胺类化合物的应用，特别涉及其在制备β-葡萄糖醛酸苷酶抑制剂中的新应用，该应用有助于对治疗伊立替康或非甾体类抗炎药引起的药源性腹泻药物的研发，属于化学医药
(二)
技术介绍
伊立替康(CPT-11)，是一种常用的治疗结肠癌的药物。当它进入人体之后，会在肝脏中被代谢成无活性的SN-38葡萄糖醛酸苷(SN-38G)，随后SN-38G经胆管排泄进入肠道，被肠道菌β-葡萄糖醛酸苷酶水解成SN-38，当SN-38在肠道中积累后会引起严重的迟发性腹泻和肠道损伤，严重影响化疗进程。此外许多服用酮洛芬、双氯芬酸和吲哚美辛等含羧酸的非甾体类抗炎药也会引起类似的肠道毒性，从而引起严重的药源性腹泻。β-葡萄糖醛酸苷酶属于糖苷酶家族2的成员，能水解β-D-连接的葡萄糖醛酸苷键。人和动物肠道内的许多微生物都可以产生β-葡萄糖醛酸苷酶，2010年有学者首次证实了抑制肠道菌β-葡萄糖苷酶能缓解CPT-11引起的药源性腹泻，随后关于肠道菌β-葡萄糖醛酸苷酶抑制剂的开发和应用受到了广泛关注。虽然肠道中的β-葡萄糖醛酸苷酶的来源不限于大肠杆菌，但大肠杆菌β-葡萄糖醛酸苷酶(EcGUS)，在人和动物肠道中普遍存在而且又易制备，因此EcGUS常被作为肠道菌β-葡萄糖醛酸苷酶抑制剂研究的常用靶标。氰基亚胺噻唑烷呋喃甲酰胺类化合物是一种含5-苯基-2-呋喃结构的衍生物。呋喃环富含电子基团，能很容易和许多生物大分子形成分子间氢键，因此含5-苯基-2-呋喃结构的化合物具有多种生物学活性，例如抗菌、抗肿瘤、抗炎、抗虫等。本专利技术中所列的化合物全都由华南农业大学崔紫宁教授慷慨提供，但该类化合物是否有EcGUS抑制活性还未有研究公布。(三)
技术实现思路
本专利技术提供了一类氰基亚胺噻唑烷呋喃甲酰胺化合物在制备β-葡萄糖醛酸苷酶抑制剂中的应用，有助于对治疗伊立替康或非甾体类抗炎药引起的药源性腹泻的药物的研发。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一种式(I)所示氰基亚胺噻唑烷呋喃甲酰胺类化合物在制备β-葡萄糖醛酸苷酶(EcGUS)抑制剂中的应用，式(I)中R为取代基，所述取代基包括氯、溴、氟、硝基、甲基、甲氧基、氢。进一步，所述R为2-Cl、3-Cl、4-Cl、2-F、4-F、2,4-Di-F、2,4-Di-F、2-NO2、4-NO2、4-Br、4-Me、4-MeO、H。进一步，所述氰基亚胺噻唑烷呋喃甲酰胺类化合物对β-葡萄糖醛酸苷酶抑制的IC50值范围为1.2μM-23.1μM。进一步，所述β-葡萄糖醛酸苷酶源自肠道菌，优选大肠杆菌；β-葡萄糖醛酸苷酶可以从生物化学制品公司采购，比如西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司，也可以从大肠杆菌中制备。进一步，所述抑制剂为治疗伊立替康或非甾体类抗炎药引起的药源性腹泻的药物。与现有技术相比，本专利技术有如下有益效果：本专利技术中的氰基亚胺噻唑烷呋喃甲酰胺类化合物对EcGUS抑制活性是首次被报道，而且抑制活性十分显著，IC50值范围为1.2μM-23.1μM(远小于阳性对照——D-葡萄糖二酸-1,4-内酯的IC50值67.3μM)，在治疗伊立替康或非甾体类抗炎药引起的药源性腹泻的药物的研发方面具有广阔的应用前景。(四)附图说明图1为氰基亚胺噻唑烷呋喃甲酰胺类化合物和D-葡萄糖二酸-1,4-内酯(终浓度10μM)对EcGUS的抑制活性图。图2为氰基亚胺噻唑烷呋喃甲酰胺类化合物和D-葡萄糖二酸-1,4-内酯对EcGUS的浓度依赖抑制曲线。图3为化合物1(A)、2(B)、3(C)对EcGUS的抑制类型图。(五)具体实施方式下面结合说明书附图和具体实施例对本专利技术作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。实施例1：EcGUS抑制剂的筛选(1)EcGUS的制备：将-80℃下保存的大肠杆菌(EscherichiacoliBL21(DE3))接种到200mL含30μg/mL卡那霉素的LB液体培养基(胰蛋白酶10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，溶剂为水，pH7.0)中，于200rpm、37℃条件下培养至OD600达到0.5，接着加入终浓度100mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，于200rpm、30℃条件下过夜培养诱导EcGUS的表达，SDS-PAGE电泳检测酶的表达情况。待表达完成后，将培养液在4℃，9000rpm条件下离心5min，收集菌体，再用PBS(pH7.4)洗涤菌体2-3遍，然后按原菌液(离心前培养液)体积的1/10加裂解液(20mM4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，300mMNaCl，5mM咪唑(imidazole)，体积浓度10％甘油(glycerol)，溶剂为水，pH7.4)20mL重悬菌体，在300W，超声10s间隔10s条件下超声破碎菌体20min(置于冰上)，接着在4℃，8000rpm条件下离心10min，取上清。然后用纯净水和NTA-0缓冲液(20mMTris-HCl，0.5M氯化钠，体积溶度10％甘油，pH7.9)各15ml分别清洗15mL的Ni-NTA琼脂糖树脂柱料(购于GE医疗公司)2～3次，再将上清与Ni-NTA琼脂糖树脂柱料在4℃下螯合3h，然后用NTA-0缓冲液r，NTA-20缓冲液(20mMTris-HCl，0.5M氯化钠，体积溶度10％甘油，20mM咪唑，pH7.9)，NTA-250缓冲液(20mMTris-HCl，0.5M氯化钠，体积溶度10％甘油，250mM咪唑，pH7.9)各15mL分别梯度洗脱，洗脱液每5mL收集一管，分别收集到9管洗脱液，每管洗脱液均进行SDS-PAGE电泳，结果显示NTA-20缓冲液收集的4管洗脱液中含有EcGUS，且EcGUS的分子量约为71kD，然后将这4管洗脱液合并，最后使用10kD的Millipore蛋白超滤管(截留分子量不应大于目的蛋白分子量的1/3)过滤，收集截留液即为酶液，获得EcGUS原酶液约7mL；(2)对硝基苯酚(PNP)标曲制作：配制1mM的PNP溶液(PBS溶解)，在96孔板中进行操作，每组做3个平行，分别加0，10，20，40，60，80μL1mM的PNP溶液，用PBS补齐至100μL，在37℃下孵育30min，使用酶标仪分别测405nM波长下0min和30min的吸光度，然后利用Excel制作散点图，得到吸光度与PNP浓度的关系式为y＝3.2617x+0.0547，其中y为吸光度，x为PNP浓度，经单位转换和去除空白干扰，在μM浓度下吸光度与PNP浓度的关系式为y＝0.003262x。(3)EcGUS抑制剂的筛选(抑制剂终浓度10μM)：抑制剂：将氰基亚胺噻唑烷呋喃甲酰胺本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种式(I)所示氰基亚胺噻唑烷呋喃甲酰胺类化合物在制备β-葡萄糖醛酸苷酶抑制剂中的应用，/n

【技术特征摘要】
1.一种式(I)所示氰基亚胺噻唑烷呋喃甲酰胺类化合物在制备β-葡萄糖醛酸苷酶抑制剂中的应用，



式(I)中R为取代基，所述取代基包括氯、溴、氟、硝基、甲基、甲氧基、氢。


2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述R为2-Cl、3-Cl、4-Cl、2-F、4-F、2,4-Di-F、2,4-Di-F、2-NO2、4-NO2、4-Br、4-Me、4-M...

【专利技术属性】
技术研发人员：王鸿，崔紫宁，魏斌，周涛顺，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33