去环氧基催化活性多肽用于呕吐毒素解毒的用途制造技术

本发明专利技术公开去环氧基催化活性多肽用于呕吐毒素解毒的用途。本发明专利技术的多肽能够在缓和的条件下催化呕吐毒素与谷胱甘肽反应去除环氧基，并产生无毒无害的谷胱甘肽化衍生物，从而实现呕吐毒素的解毒和脱毒。该多肽在农业、食品、饲料和医药等领域具有广泛用途。

【技术实现步骤摘要】
去环氧基催化活性多肽用于呕吐毒素解毒的用途
本专利技术涉及食品或饲料领域，具体涉及具有去环氧基催化活性的活性多肽用于呕吐毒素或含有该毒素的样品解毒或脱毒的用途。
技术介绍
呕吐毒素主要由禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌、拟枝孢镰刀菌、粉红镰刀菌、雪腐镰刀菌等镰刀菌产生。另外，头孢菌属、漆班菌属、木霉属等的菌株也可产生该毒素。摄入此类毒素可引起采食量降低，严重时可引起例如呕吐，故又名呕吐毒素(vomitoxin，VT)。科研工作者已经探明呕吐毒素的环氧基是主要毒性来源基团。因此，分离出可高效去除呕吐毒素的环氧基的基因或酶，通过体外酶催化处理受毒素污染的谷物制品，将满足饲料工业、食品工业和医药产业对呕吐毒素的脱毒需求。遗憾的是，目前尚未报道有明确的基因或蛋白可通过去环氧基催化呕吐毒素进行解毒。
技术实现思路
鉴于现有技术存在的问题，专利技术人提供一种基于具有去环氧基催化活性的活性多肽进行呕吐毒素解毒的方法。至少部分地基于此完成了本专利技术，具体地，本专利技术包括以下内容。本专利技术的第一方面，提供具有去环氧基催化活性的多肽用于呕吐毒素解毒的用途，其中，所述活性多肽具有SEQIDNo:1所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述活性多肽能够使呕吐毒素中的环氧基与谷胱甘肽(GSH)催化反应生成谷胱甘肽化衍生物。本专利技术的第二方面，提供活性多肽用于样品脱毒的用途，其中，所述活性多肽具有SEQIDNo:1所示的氨基酸序列，所述样品为呕吐毒素污染的样品。在某些实施方案中，所述样品为食品、饲料或饮料。在某些实施方案中，所述样品包含谷胱甘肽，或向所述样品加入谷胱甘肽。在某些实施方案中，所述样品来源于镰刀菌属、头孢菌属、漆班菌属和木霉属的细菌侵染的植物。在某些实施方案中，所述镰刀菌属细菌选自禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌、拟枝孢镰刀菌、粉红镰刀菌、黄色镰刀菌和雪腐镰刀菌。本专利技术的第三方面，提供降低或减轻细胞毒性的方法，其包括将具有SEQIDNo:1所示氨基酸序列的多肽引入细胞或与细胞接触的步骤。优选地，在细胞内引入具有表达所述多肽的基因的步骤。本专利技术的活性多肽能够有效地去除呕吐毒素中的环氧基团，从而消除或降低其毒性。活性多肽作为酶反应条件缓和，特别适合于食品或饲料工业。因此，具有巨大的潜在应用价值。附图说明图1活性多肽纯化后的SDS-PAGE分析图。图2活性多肽的量对酶促反应的影响。(a)酶促反应底物呕吐毒素(DON)减少情况；(b)酶促反应生成物DON-GSH生成情况。图3反应缓冲液pH值对酶促反应的影响。(a)酶促反应底物呕吐毒素(DON)减少情况；(b)酶促反应生成物DON-GSH生成情况。图4反应温度对酶促反应的影响。(a)酶促反应底物呕吐毒素减少情况；(b)酶促反应生成物DON-GSH生成情况。图5A为LC-HRMS(方法1)DON与GSH体外酶促反应的提取离子流谱图EIC。图5B为LC-HRMS2(方法2)DON与GSH体外酶促反应获得的DON-GSH的高能碰撞解离产生的子离子质谱图。图6呕吐毒素对细胞活力的影响。不同浓度梯度的DON(a)处理细胞48h后，测定OD450nm。图7LC-HRMS(方法1)毒素处理转基因酵母提取的离子色谱图。图8转基因毕赤酵母的DON耐受性结果。具体实施方式现详细说明本专利技术的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本专利技术的限制，而应理解为是对本专利技术的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。应理解本专利技术中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本专利技术。另外，对于本专利技术中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本专利技术内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本专利技术所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本专利技术仅描述了优选的方法和材料，但是在本专利技术的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。除非另有说明，否则“％”为基于重量的百分数。本文中，术语“活性多肽”是指具有去环氧基酶催化活性的多肽，即将环氧基转化为其他基团或去除该基团的活性多肽。本文有时也称作“蛋白酶”。本文中，术语“去环氧基催化活性”是指能够将呕吐毒素中的环氧基(优选在第12位碳、第13位碳上形成的环氧基)去除的活性或功能。具体催化过程如下所示：实施例一、本专利技术活性多肽的制备1.材料与方法大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α菌株、表达菌株BL21(DE3)、原核表达载体pET-28a(+)及质粒pMD19-T-ThFhb7由本实验室保存，其中质粒pMD19-T-ThFhb7含有来源于长穗偃麦草的去环氧基酶基因，其序列如SEQIDNo.2所示。1.2实验方法1.2.1通过下述方法构建重组表达载体pET28a-ThFhb7。根据表达载体pET28a设计带有NcoI和BamHI酶切位点位点的引物，引物序列如下(下划线指示酶切位点)：正向引物：5'-CCATGGCTAGAAATCCACCCATCGTCATCACC-3'反向引物：5'-GGATCCTCTTCACCTCGGCATACTTGTC-3'以质粒pMD19-T-ThFhb7为模版进行PCR扩增。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收目的片段；用NcoI和BamHI分别将目的片段及pET28a载体进行双酶切，胶回收后用T4连接酶连接；连接产物转化大肠杆菌DH5α，经菌落PCR和双酶切鉴定得到约900bp的目的基因和约5000bp的pET28a载体骨架。进一步进行测序验证，结果证明重组表达载体pET28a-ThFhb7序列和读码框正确。1.2.2多肽诱导表达将重组表达载体质粒pET28a-ThFhb7转入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)感受态细胞；经PCR检测挑取转化平板上的阳性单克隆接种于含50μg/mLKana的3mLLB培养液的试管中，37℃220r/min振摇过夜。次日接种于KanaLB培养液中振摇至菌体OD600为0.6～0.8。取出1mL培养物，室温离心2min，弃上清，用100μl1×上样缓冲液重悬菌体沉淀。向剩余的培养物中加入IPTG至终浓度为0.5mM，37℃220r/min振摇4h，诱导融合蛋白表达。取出1ml培养物，10000r/min室温离心2min，弃上清，用100μl1×上样缓冲液重悬菌体沉淀。剩余培养物4000r/min，离心10min，弃上清，用PBS重悬菌体沉淀；重悬液进行超声波破碎后，分别本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.去环氧基催化活性多肽用于呕吐毒素解毒的用途，其特征在于，所述活性多肽具有SEQ ID No:1所示的氨基酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.去环氧基催化活性多肽用于呕吐毒素解毒的用途，其特征在于，所述活性多肽具有SEQIDNo:1所示的氨基酸序列。


2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述活性多肽能够使呕吐毒素中的环氧基与谷胱甘肽催化反应生成谷胱甘肽化衍生物。


3.去环氧基催化活性多肽用于样品脱毒的用途，其特征在于，所述活性多肽具有SEQIDNo:1所示的氨基酸序列，所述样品为呕吐毒素污染的样品。


4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述样品为食品、饲料或饮料。


5.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述样品包含谷胱甘肽，或向所述样品加入谷胱甘肽。


6.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：孔令让，王宏伟，孙思龙，侯冰倩，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37