一种高尿酸血症大鼠模型及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一种高尿酸血症大鼠模型及其构建方法，属于基因工程技术领域。本发明专利技术公开的高尿酸血症大鼠模型，先采用CRISPR/Cas9技术敲除SD大鼠的尿酸酶基因获得杂合子，然后通过血清尿酸表型筛选、肝匀浆酶活性、肝RNART‑PCR和肝匀浆蛋白WesternBlot技术证明无尿酸酶表达，继而获得尿酸酶缺失大鼠(Uox‑/‑大鼠)；接下来通过反复选种杂交，将大鼠繁育7代后，雄性和雌性大鼠血清尿酸水平均达到诊断水平。该模型1年存活期达95％，具有可繁殖性。该高尿酸血症大鼠模型特别适合用来研究高尿酸血症的机制，筛选降尿酸药物，并可进一步用于痛风的研究，具有良好应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种高尿酸血症大鼠模型及其构建方法
本专利技术涉及基因工程
，更具体的说是涉及一种高尿酸血症大鼠模型及其构建方法。
技术介绍
痛风(gout)已是现代社会的常见病和多发病，男性多发，主要发病机制与长期嘌呤代谢障碍、血清尿酸增高有关。一般认为高尿酸血症(hyperuricemia，男性高于70μg/ml，即420μM)是痛风的基础。此病由来已久，最早以欧洲和北美较为多见。我国在20世纪80年代后的患病情况有明显的上升趋势，且男性高于女性，如2006年山东沿海地区流行病学调查显示高尿酸血症的男性患病率为18.3％，痛风为1.94％。目前未见大规模流行病学调查，但有报道称某些地方(如云南布朗山地区)的痛风发病率可高达10％以上。最近的临床研究也表明，高尿酸血症与多种疾病包括高血压、糖尿病和高血脂等关联，也被认为是这些疾病的高危因素，甚至高尿酸血症已经成为例行健康体检必查的“第4高”(其他3高为：高血压、高血糖、高血脂)。尿酸难溶于水，可被尿酸酶(Uox)转化成水溶性较高的尿囊素。人(灵长目)在进化过程中，丢失了该酶。因此，人类易罹患高尿酸血症和痛风；而含有尿酸酶的动物几乎不自发此病。为了尽可能模拟人类痛风和高尿酸血症，尿酸酶缺乏是理想模型动物的前提。已知天然缺乏该酶的哺乳动物有大象、海牛，以及非人灵长类猿等。这些动物的饲养管理昂贵，少有实验用模式动物。大鼠和小鼠是哺乳动物，杂食，基因组与人相似性高，但在尿酸酶缺失小鼠未研制出来之前，痛风和高尿酸血症的模型制作在动物选择和造模方法上五花八门，很难全面模拟临床现象；这也反映了大量相关科研工作者的无奈。较理想高尿酸血症动物模型应该满足以下5个条件，即：1)造模的动物最好为哺乳类，与人类接近；2)像大小鼠一样，食谱与人相似(杂食)，繁殖快、饲养管理简便(经济)；3)没有尿酸酶的干扰，嘌呤代谢途径与人一致；4)正常饲养条件下，血清尿酸水平达到临床诊断水平(雄性动物血清尿酸高于70μg/ml)；5)能长期存活，个体差异小，能稳定繁殖。大鼠和小鼠常用来研究痛风和高尿酸血症，模型众多。然而，普通大鼠和小鼠表达尿酸酶，以此动物制备的痛风和高尿酸血症模型与临床存在较大差异。首先，普通大小鼠的血清尿酸值与人存在较大差别：普通大鼠(雄)的血清尿酸水平在20-30μg/ml(120-180μM)，普通雄性小鼠(含昆明种和ICR)的血清尿酸水平也大体相似(约22μg/ml)，均低于人的参考值(25-70μg/ml，男)。但血肌酐和尿素氮的参考值则与人是接近的，说明大小鼠与人存在的血清尿酸水平差异与肾功能无关。其次，用普通大小鼠药物造模的高尿酸血症与临床差异较大：目前使用的大小鼠高尿酸血症造模策略主要有：1)高嘌呤饮食模型；2)使用尿酸酶抑制剂；和/或3)抑制尿酸排泄。由于尿酸酶的存在，单纯的高嘌呤饮食几乎无法造成长期且稳定的高尿酸血症。因此，使用尿酸酶抑制剂(氧嗪酸钾)便成了造模的必备药物，也有人用果糖或乙胺丁醇抑制尿酸排泄的大小鼠模型。然而，这些措施虽然能一定程度地升高血清尿酸，但血清尿酸值升高有限，很难达到高尿酸血症的诊断水平，却往往能造成严重的肾损害。比如，不论是腺嘌呤(300mg/kg)或腺嘌呤+氧嗪酸钾(150+200mg/kg)，均可以造成大鼠严重肾损害，但血清尿酸却只能从20μg/ml升高到60μg/ml附近；用雄性小鼠(ICR)制备高尿酸血症模型(氧嗪酸钾，500mg/kg)，血清尿酸也只能升高到40μg/ml左右；采用果糖或乙胺丁醇抑制大小鼠的尿酸排泄，血清尿酸也很难升高到70μg/ml水平。而人的血清尿酸即便达到70μg/ml(男性正范围的最高值)，导致的肾损害很少发生。这说明药物模型只能模仿血清尿酸升高，与临床的“高尿酸血症”差距明显。值得说明的是，除高嘌呤饮食外，尿酸酶抑制剂或尿酸排泄抑制剂导致的血清尿酸升高不是临床常见致病因素。这些因素的带入必然将模型复杂化，甚至严重偏离临床实际。比如，常用的尿酸酶抑制剂氧嗪酸钾(potassiumoxonate)又叫奥替拉西钾(oteracilpotassium)，本身是乳清酸磷酸核糖转移酶(orotatephosphoribosyl-transferase，OPRT)抑制剂，临床用作5-氟尿嘧啶口服抗肿瘤的消化道保护剂，尿酸酶抑制为其“副作用”；众所周知，果糖(食物)和乙胺丁醇(抗结核药)的主流作用都不涉及尿酸。再次，基于普通大小的鼠痛风模型与人也存在较大差别：几乎没有大小鼠的自发痛风模型；如果要造模，往往将尿酸结晶注入到相关部位(如关节腔)来造模。由于鼠类表达尿酸酶，因此痛风的自愈能力很强，这种模型很难稳定，与临床差异也很明显。由此看来，用普通大小鼠制造高尿酸血症模型与人存在较大的差异。其原因在于普通鼠类表达尿酸酶，而且该酶还存在诱导现象，长期的尿酸增多会促进尿酸酶表达，甚至导致实验失败(自愈)。对比理想条件，大小鼠的尿酸酶缺失为获得痛风和高尿酸血症理想模型动物提供了可能。目前已有尿酸酶缺失(Uox-/-)小鼠，但仍有不足。如C57BL/6J小鼠是体格优良、繁殖好、寿命较长、体毛黑色的近交系小鼠。以这种小鼠为背景建立的转基因或基因敲除鼠，只要雌雄纯合子成活且能繁育即可获得新的近交系(突变系)动物。因此基因工程小鼠大多以该近交系为背景。早期基因工程技术研制的尿酸酶缺失小鼠：早在1994年就有人采用胚胎干细胞同源重组技术构建了Uox-/-小鼠(C57BL/6J)模型，血清尿酸可以升高到140μg/ml(833μM)以上。不幸的是，该Uox-/-小鼠的半数生存期不过4周，原因是易发肾功能衰竭而亡。好在这种方法获得了Uox+/-小鼠(表观与正常小鼠无异)，通过再次杂交可以继续获得Uox-/-小鼠。这似乎解决了Uox-/-小鼠的生产问题，但缺点还是明显的：1)繁殖管理复杂，Uox-/-小鼠必须重新杂交并鉴定；2)生产效率低，Uox+/-小鼠交配后获得Uox-/-小鼠的概率仅为1/4；3)Uox-/-小鼠存活时间短，最长寿命11周，很难进行长时间实验研究。最近基因工程技术研制的尿酸酶缺失小鼠：2018年1月，我国青岛大学采用是TALEN(transcriptionactivator-likeeffectornuclease)敲除技术重新构建了C57BL/6J小鼠的Uox-/-模型动物，能将40％小鼠的生存期延长到63周以上，血清尿酸水平在500μM左右，符合高尿酸血症，但肾损伤明显，这有望实现基因敲除小鼠的规模繁殖。遗憾的是，这种模型小鼠免疫力差，寿命明显短于正常小鼠，表型(血清尿酸、糖脂代谢、肾功能)与临床差异仍较大，且必须在无菌环境饲养。青岛大学后续还用CRISPR/Cas9技术重新获得了尿酸酶缺失小鼠，但以上缺陷仍未得到很好的解决，如肾损伤严重，肠道屏障损害严重等。因此，提供一种高尿酸血症大鼠模型及其构建方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种高尿酸血症大鼠模型及其构建方法。为了实现上述目的，本专利技术采用如本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高尿酸血症大鼠模型，其特征在于，所述高尿酸血症大鼠模型不表达尿酸酶；在常规饲养条件下，雄性模型血清尿酸水平高于70μg/ml，雌性模型血清尿酸水平高于60μg/ml。/n

【技术特征摘要】
1.一种高尿酸血症大鼠模型，其特征在于，所述高尿酸血症大鼠模型不表达尿酸酶；在常规饲养条件下，雄性模型血清尿酸水平高于70μg/ml，雌性模型血清尿酸水平高于60μg/ml。


2.根据权利要求1所述的一种高尿酸血症大鼠模型，其特征在于，所述高尿酸血症大鼠模型对抑制尿酸合成的药物具有剂量依赖性的反应性。


3.根据权利要求1所述的一种高尿酸血症大鼠模型，其特征在于，所述高尿酸血症大鼠模型对促进尿酸排泄的药物具有剂量依赖性的反应性。


4.根据权利要求1所述的一种高尿酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：段为钢，
申请(专利权)人：段为钢，
类型：发明
国别省市：云南;53