一种山楂中主要活性成分的仿生代谢方法技术

本发明专利技术涉及天然药物仿生代谢技术领域，为解决传统天然药物仿生代谢方法反应复杂，检测灵敏度低的问题，提供了一种山楂中主要活性成分的仿生代谢方法，包括以下步骤：(1)配制标准品溶液，与GSH溶液混合，注入质谱中进行分析表征其代谢产物；(2)将大鼠肝微粒体蛋白和山楂类标准品溶解在磷酸盐缓冲溶液中，加入氯化镁和β‑NADP进行孵育，孵育完成后加入乙腈，离心，取上清液通过LC‑MS分析表征其代谢产物；(3)将代谢产物进行比较。本发明专利技术将在线电化学与质谱技术巧妙结合起来，以及与肝微粒体体外孵育代谢相比较，能便捷高效地模拟出山楂中的主要活性成分的代谢产物。

【技术实现步骤摘要】
一种山楂中主要活性成分的仿生代谢方法
本专利技术涉及天然药物仿生代谢
，尤其涉及一种山楂中主要活性成分的仿生代谢方法。
技术介绍
山楂是蔷薇科山楂属药用植物的常见名称，因其有益的健康效应和低毒性，在中国，欧洲和北美洲等地被广泛用于药用和食品原料。最近的研究表明，山楂具有多种生物活性，如抗氧化活性，抗发炎，抗高血压，抗心律失常和降血脂等作用。山楂提取物中含有大量的生物活性物质:甾醇，三萜类，类黄酮，原花色素，有机酸等，其中黄酮类化合物是最重要，最有效的成分之一，是决定山楂质量的主要成分。黄酮类化合物，主要由金丝桃苷，槲皮素，槲皮苷，异槲皮苷，芦丁，牡荆素，异牡荆素和表儿茶素等组成。据报道，黄酮类化合物的消耗与冠心病死亡率呈负相关。黄酮类化合物的这些生理学益处通常被认为是由于它们的抗氧化和自由基清除特性。因其独特的医学效益，山楂和山楂衍生的工业副产品被广泛用于治疗慢性心力衰竭和各种消化系统疾病，改善冠状动脉血流，降低血浆胆固醇和甘油三酯滞等。虽然已经基本报道了山楂黄酮的药理作用，但它们的体内代谢机制尚未明确定义。代谢调查对于预测和理解山楂活性物质的代谢稳定性以及所产生的代谢物与人体之间可能的相互作用至关重要。代谢通常可分为两个不同的阶段。I相反应主要是氧化反应，由来自细胞色素P450家族的酶在肝脏中催化所产生的代谢物直接由肾脏或胆汁排泄，或者它可以经历II相代谢步骤，其中小而亲水生物分子，如谷胱甘肽(GSH)，与I相代谢产物偶联。GSH是动物细胞中存在的主要低分子量硫醇，在解毒中起着重要作用，是研究蛋白质反应性的常用替代物。这些研究通常使用实验室动物体内代谢或基于体外代谢模型进行。代谢研究中的典型体外方法包括使用重组表达的细胞色素P450酶，匀浆或来自人或动物肝脏，肝切片和人肝细胞的微粒体研究。肝细胞具有高水平的细胞色素P450活性，而肝脏是参与各种内源性化合物和药物生物转化的主要器官。因此，由于微粒体代谢模型应用操作简单、价格合理、储存简单方便，被广泛用于药物代谢研究初期的高通量筛选。然而，由于该体系中含有大量的脂类物质和其它蛋白质,容易降低药物在体系中的游离浓度，从而使实验结果出现偏差。近年来，人们对可以提供可能代谢物可靠信息的新方法越来越感兴趣。Hambitzer和Heitbaum开发一种用于模拟氧化代谢反应的新的纯工具方法。他们构建了用于电化学(EC)氧化N，N-二甲基苯胺的三电极组件并将其连接到热喷射质谱(MS)系统。近年来，EC与MS的在线组合在评估代谢途径的预测方面取得了重大进展。还有研究通过比较EC/LC/MS产生的代谢物与P450系统产生的代谢物，研究了该技术可用于模拟细胞色素P450催化反应的程度。且研究结果表明，通过单电子氧化或氢提取引发的机制进行的N-脱烷基化，S-氧化，P-氧化，醇氧化和脱氢等反应都适用于电化学氧化。在接下来的几年中，报道了许多研究表明EC/MS系统的广泛适用性。有报道详细研究了电化学氧化，活化并且与内源化合物缀合这一方面。还有研究证明在电化学电池中产生的活性代谢物可以与GSH偶联。该系统已成功用于模拟众多化合物的代谢，如双氯芬酸，曲格列酮和四氢西泮。与化学氧化相比，由电化学电池进行的氧化不需要去除试剂，并且电化学流动池可以容易地在线耦合到质谱上，从而实现快速地分析氧化反应，避免亲电子代谢物的化学反应性对实验结果的干扰。
技术实现思路
本专利技术为了克服传统天然药物仿生代谢方法反应复杂，检测灵敏度低的问题，提供了一种山楂中主要活性成分的仿生代谢方法，该方法简便快捷，对人体无毒、不污染环境，不违反伦理道德，灵敏度高，重现性好。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种山楂中主要活性成分的仿生代谢方法，包括以下步骤：(1)称取山楂类标准品配制成标准品溶液，将标准溶液经电化学氧化后与GSH溶液混合，注入质谱中进行分析表征其代谢产物；(2)将大鼠肝微粒体蛋白和山楂类标准品溶解在磷酸盐缓冲溶液中，加入氯化镁和β-NADP进行孵育，孵育完成后加入乙腈，离心，取上清液通过LC-MS分析表征其代谢产物；(3)将步骤(1)与步骤(2)中的代谢产物进行比较。本专利技术具体提供了一种以谷胱甘肽作为研究蛋白质反应性的常用替代物和电化学联用质谱的技术，用于模拟代谢山楂中的主要活性化合物。具体包括：配置一定浓度的标准溶液，以一定的流速同时注入GSH至质谱中进行分析。所获得的结果与肝微粒体体外孵育的结果进行比较，看是否山楂中活性成分的仿生代谢的结果存在差异。本专利技术的要点在于电化学转化与质谱在线耦合对山楂中主要活性成分的模拟仿生代谢研究，充分发挥了电化学转化与质谱在线耦合的优点，用这一组合技术模拟仿生代谢天然产物中的主要有效成分，可以取得前所未有、立竿见影的效果。本专利技术成功联用在线电化学与质谱应用于研究山楂活性成分的在线监测，并在GSH存在下实现I期和II期代谢物的成功生成和鉴定。所采用的现有技术清楚地证实了模拟的山楂活性成分的几种氧化代谢途径，包括甲基化、乙酰化、葡萄糖醛酸化、脱羧及水解反应。该方法相较于传统的代谢方法简便快捷；对人体无毒、不污染环境；不违反伦理道德。此外，灵敏度大大提高，重现性较好。该系统的简单适用性以及它便捷可重复性使其成为中药代谢研究中的有用工具。本方法应用范围广泛，无论是山楂的活性成分还是其他药材，如丹参均能用本专利技术方法进行仿生代谢。本专利技术表明肝微粒体体外孵育与在线电化学与质谱联用方法具有可比较性，而且代谢结果具有较高相似性。作为优选，步骤(1)中，所述标准品溶液的配制方法如下：在中性介质中，将100μM山楂类标准品溶解于由50％乙腈和50％水组成的20mM甲酸铵缓冲液中，并通过20-22％LC-MS级氨水调节pH至7.4，摇匀；通过0.22μm滤膜过滤，并转移至注射器中。作为优选，步骤(1)中，所述GSH溶液的浓度为300μM。作为优选，步骤(1)中，所述GSH溶液通过T-片以10μL/min的流速加入到电化学流出物中。作为优选，步骤(2)中，所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为50mM。作为优选，步骤(2)中，孵育温度为35～37℃，孵育时间控制在60～90min。作为优选，步骤(2)中，所述大鼠肝微粒体蛋白的浓度为1.3mg/mL。作为优选，步骤(2)中，所述氯化镁的浓度为0.5mM。作为优选，步骤(2)中，所述β-NADP的浓度为1.2mM。作为优选，所述山楂类标准品选自金丝桃苷，异槲皮苷，绿原酸和表儿茶素中的一种。因此，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术将在线电化学与质谱技术巧妙结合起来，以及与肝微粒体体外孵育代谢相比较，能便捷高效地模拟出山楂中的主要活性成分的代谢产物。附图说明图1为本专利技术仿生代谢的流程图。图2为在0.1-1.5V电位范围内金丝桃苷的伏安质量图。图3为山楂中金丝桃苷的氧化途径图。图4为在0.1-1.3V电位范围内异槲皮苷的伏安质量图。图5为山楂中异槲皮苷的氧化途径图。图6为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种山楂中主要活性成分的仿生代谢方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)称取山楂类标准品配制成标准品溶液，将标准溶液经电化学氧化后与GSH溶液混合，注入质谱中进行分析表征其代谢产物；/n(2)将大鼠肝微粒体蛋白和山楂类标准品溶解在磷酸盐缓冲溶液中，加入氯化镁和β-NADP进行孵育，孵育完成后加入乙腈，离心，取上清液通过LC-MS分析表征其代谢产物；/n(3)将步骤(1)与步骤(2)中的代谢产物进行比较。/n

【技术特征摘要】
1.一种山楂中主要活性成分的仿生代谢方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)称取山楂类标准品配制成标准品溶液，将标准溶液经电化学氧化后与GSH溶液混合，注入质谱中进行分析表征其代谢产物；
(2)将大鼠肝微粒体蛋白和山楂类标准品溶解在磷酸盐缓冲溶液中，加入氯化镁和β-NADP进行孵育，孵育完成后加入乙腈，离心，取上清液通过LC-MS分析表征其代谢产物；
(3)将步骤(1)与步骤(2)中的代谢产物进行比较。


2.根据权利要求1所述的一种山楂中主要活性成分的仿生代谢方法，其特征在于，步骤(1)中，所述标准品溶液的配制方法如下：在中性介质中，将100μM山楂类标准品溶解于由50％乙腈和50％水组成的20mM甲酸铵缓冲液中，并通过20-22％LC-MS级氨水调节pH至7.4，摇匀；通过0.22μm滤膜过滤，并转移至注射器中。


3.根据权利要求1所述的一种山楂中主要活性成分的仿生代谢方法，其特征在于，步骤(1)中，所述GSH溶液的浓度为300μM。


4.根据权利要求1所述的一种山楂中主要活性成分的仿生代谢方法，其特征在于，步骤(...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹君，王秋燕，胡雨涵，杨娟，
申请(专利权)人：杭州师范大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33