一种液相色谱串联质谱检测蜂蜜中意蜂和中蜂葡萄糖脱氢酶的方法技术

本发明专利技术涉及一种液相色谱串联质谱检测中蜂蜜和意蜂蜜的葡萄糖脱氢酶的方法，包括：筛选分别属于中蜂蜜和意蜂蜜中葡萄糖脱氢酶的特征肽段，建立液相色谱串联质谱检测方法，样品前处理，液相色谱分离以及串联质谱检测和数据分析；所述特征肽段包括意蜂葡萄糖脱氢酶特征肽段：ITLDNNQSVQVR和中蜂葡萄糖脱氢酶特征肽段：FPYQPPFAWEILK。本发明专利技术所提出的蜂蜜中葡萄糖脱氢酶的检测方法，具有较高的准确度、精确度和灵敏度，并且稳定性强，适用于区别意蜂蜜和中蜂蜜，尤其适用于中蜂蜜中掺入意蜂蜜的鉴别。该方法对保护蜂蜜消费者的权益和维护蜂产品行业的健康发展具有重要现实意义。

【技术实现步骤摘要】
一种液相色谱串联质谱检测蜂蜜中意蜂和中蜂葡萄糖脱氢酶的方法
本专利技术涉及食品检测领域，具体为一种液相色谱串联质谱检测蜂蜜中葡萄糖脱氢酶的方法，该方法适用于鉴别中蜂蜜和意蜂蜜。
技术介绍
蜂蜜营养丰富、口感香甜，并且具有一定美容、润肠和保健等功效，深受人们喜爱。此外，蜂蜜中含有丰富的营养和活性物质，如酚酸、黄酮等，使得蜂蜜具有一定的药用价值，具有消炎、抗菌、抗氧化等作用，被用于医药和化妆品等方面。与意蜂蜜相比，中蜂蜜口感更佳，更受到消费者的喜爱，但是中蜂平均每群的产量只有意蜂1/5左右，从而导致市场供不应求。当前，中蜂蜜的价格大约是意蜂蜜的5-10倍左右。面对利益的诱惑，部分商家在中蜂蜜中掺入低价的意蜂蜜或者直接以糖浆制作掺假中蜂蜜，流入市场。掺假中蜂蜜不仅扰乱蜂蜜市场正常秩序，而且损害蜂农和消费者的权益。如何保证中蜂蜜的真实性，防止中蜂蜜中掺入意蜂蜜成为当前养蜂业急需解决的一项难题。蜜蜂在酿造蜂蜜过程中，需要在蜂蜜中混入众多的酶类物质使蜂蜜酿制成熟，便于长时间存储，如葡萄糖脱氢酶、淀粉酶、超氧化物歧化酶等。中蜂蜜和意蜂蜜中均含有这些酶类物质，由于这些酶类物质是有蜜蜂分泌的，属于动物源性蛋白质，在表征蜂蜜的动物源性来源方面具有一定示踪作用。葡萄糖脱氢酶同时存在于意蜂蜜及中蜂蜜中，但在这两种蜂蜜中葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列不同，两者属于同源性蛋白质。葡萄糖脱氢酶是一种可溶性的蛋白，主要功能是在烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的作用下催化葡萄糖生成葡萄糖酸，从而使得蜂蜜呈现酸性，使蜂蜜具有抗菌和长时间保鲜作用。近年来，液相色谱串联质谱技术在蛋白质的定性和定量分析方面，具有显著的高选择性和高灵敏度优点，非常适用于复杂生物基质中蛋白质的准确表征、鉴定。目前，尚未报道采用该技术用于定量检测蜂蜜中葡萄糖脱氢酶。
技术实现思路
为了解决现有技术存在的问题，本专利技术提供一种液相色谱串联质谱检测蜂蜜中葡萄糖脱氢酶的方法，通过意蜂蜜和中蜂蜜中葡萄糖脱氢酶的特有肽段的检测对生产和商业中的中蜂蜜和意蜂蜜的真假进行鉴定。第一方面，本专利技术筛选出可用于液相色谱串联质谱鉴定中蜂蜜和意蜂蜜的葡萄糖脱氢酶的特征肽段组：意蜂蜜葡萄糖脱氢酶的特征肽段：ITLDNNQSVQVR，中蜂蜜葡萄糖脱氢酶的特征肽段：FPYQPPFAWEILK。本专利技术根据意蜂蜜和中蜂蜜酶解产物的液相色谱串联质谱检测结果，成功筛选出意蜂蜜特征肽段：ITLDNNQSVQVR，中蜂蜜特征肽段：FPYQPPFAWEILK，两者特异性通过Uniprot数据库进行了验证。进一步，意蜂蜜的葡萄糖脱氢酶的特征肽段ITLDNNQSVQVR在质谱中所产生的检测信号的母离子具有m/z693.87042的质荷比，包含质荷比为m/z1059.51776、m/z944.49082的子离子。中蜂蜜的葡萄糖脱氢酶的特征肽段FPYQPPFAWEILK在质谱中所产生的检测信号的母离子具有m/z818.43213的质荷比，包含质荷比为m/z1100.61389、m/z1003.56113的子离子。第二方面，本专利技术提供一种液相色谱串联质谱检测蜂蜜中葡萄糖脱氢酶的方法。具体地，所述方法具体步骤如下：A、根据筛选出的专属于意蜂蜜的葡萄糖脱氢酶的特征肽段和中蜂蜜的葡萄糖脱氢酶的特征肽段的母离子质荷比、子离子质荷比、碰撞能等信息建立液相色谱串联质谱检测方法。B、提取待测蜂蜜中的蛋白质，用胰蛋白酶进行酶切，对酶解产物除盐后作为待测样本，使用液相色谱串联质谱检测；C、在质谱检测结果中提取筛选的特征肽段，以鉴别蜂蜜为意蜂蜜或中蜂蜜。进一步地，步骤A和B中采用UHPLC-QExactiveplus进行液相色谱串联质谱检测。a1、液相色谱条件如下：色谱柱：为C18柱；流动相组成：流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为含0.1%甲酸的乙腈；梯度洗脱条件为：0-0.5min，5%的B；0.5-1.0min，5-15%的B；1.0-6.5min，15-40%的B；6.5-7.0min，40-95%的B；7.0-8.5min，95%的B；8.5-8.6min，95-5%B，8.6-10.0min，5%的B；流速：0.30mL/min；进样量：5.0µL；a2、质谱条件如下：离子源参数：鞘气的流速38；辅助气的流速15；挡锥气的流速0；电喷雾电压3.2kV；离子导管的温度275℃；S-lensRFlevel设为60；离子源温度380℃；采集的模式为正离子模式下的FullMS-ddMS2。该方法采用UHPLC-QExactivePlus（超高效液相色谱-四级杆串联高分辨静电轨道阱）检测蜂蜜样本，通过在待测样品的质谱图中提取属于中蜂葡萄糖脱氢酶特征肽段和意蜂葡萄糖脱氢酶特征肽段的质荷比，若待测样品在正确的保留时间中仅提取出中蜂葡萄糖脱氢酶特征肽段，且子离子也符合，则可判断为中蜂蜜；若待测样品在正确的保留时间中仅提取出意蜂葡萄糖脱氢酶特征肽段，且子离子也符合，则可判断为意蜂蜜；若待测样品在正确的保留时间中同时提取出中蜂和意蜂葡萄糖脱氢酶特征肽段，且子离子也符合，则判断为中、意蜂蜜混掺。应当理解的是，对上述所用试剂或原料的用量进行等比例扩大或者缩小后的技术方案，与上述内容实质等同，均属于本专利技术保护范围。本专利技术采用UHPLC-QExactiveplus仪器检测蜂蜜中的葡萄糖脱氢酶，基于高分辨质谱提供的精确质量数，该方法具有较高的特异性和灵敏度。基于本方法采用的仪器和参数，不同分析实验室和检测机构可以依据液相串联高分辨质谱技术的相关知识，对其中的参数进行一定调整，上述调整均属于本专利技术保护范围。本专利技术提供一种液相色谱串联质谱检测中蜂蜜和意蜂蜜葡萄糖脱氢酶的方法，至少具有如下有益效果：本专利技术研究发现，意蜂葡萄糖脱氢酶和中蜂葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列有区别，可以确定各自的特异性的肽段，本专利技术据此建立起一套鉴别中蜂蜜和意蜂蜜的方法，用于辅助蜂蜜掺假的鉴别。本专利技术提供的蜂蜜中中蜂和意蜂葡萄糖脱氢酶的检测方法，具有特异性强、灵敏度高、准确度和精确度好等优点。该方法对于维护蜂蜜消费行业健康发展和蜂蜜消费者的权益意义重大。附图说明图1为本专利技术实施例1提供的通过UHPLC-QExactiveplus提取的意蜂葡萄糖脱氢酶特征肽段和中蜂葡萄糖脱氢酶的特征肽段的离子流图；图2为本专利技术实施例1提供的通过UHPLC-QExactiveplus检测的意蜂葡萄糖脱氢酶特征肽段和中蜂葡萄糖脱氢酶的特征肽段的质谱图；图3为本专利技术实施例1提供的通过UHPLC-QExactiveplus检测的意蜂葡萄糖脱氢酶特征肽段和中蜂葡萄糖脱氢酶的特征肽段的二级碎片质谱图；图4为本专利技术实施例1提供的意蜂蜜葡萄糖脱氢酶几种候选特征肽段在UHPLC-QExactiveplus上的相对丰度比较图；图5为本专利技术实施例2提供的向中蜂蜜中掺入意蜂蜜后的检测结果；图6为本专利技术实施例3提供的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种液相色谱串联质谱检测蜂蜜中意蜂和中蜂葡萄糖脱氢酶的方法，其特征在于，包括：通过液相色谱串联质谱法检测待测蜂蜜中葡萄糖脱氢酶的特征肽段，所述特征肽段包括肽段：/n意蜂蜜葡萄糖脱氢酶特征肽段：ITLDNNQSVQVR，/n中蜂蜜葡萄糖脱氢酶特征肽段：FPYQPPFAWEILK。/n

【技术特征摘要】
1.一种液相色谱串联质谱检测蜂蜜中意蜂和中蜂葡萄糖脱氢酶的方法，其特征在于，包括：通过液相色谱串联质谱法检测待测蜂蜜中葡萄糖脱氢酶的特征肽段，所述特征肽段包括肽段：
意蜂蜜葡萄糖脱氢酶特征肽段：ITLDNNQSVQVR，
中蜂蜜葡萄糖脱氢酶特征肽段：FPYQPPFAWEILK。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：
A、对真实的中蜂蜜和意蜂蜜进行酶解，酶解产物除盐后干燥，用0.1%的甲酸水溶液复溶，然后进行液相色谱串联质谱检测；
B、根据液相色谱串联质谱检测结果，筛选出专属于意蜂蜜的葡萄糖脱氢酶的特征肽段和中蜂蜜的葡萄糖脱氢酶的特征肽段；
C、提取待测蜂蜜中的蛋白质，用胰蛋白酶进行酶切，对酶解产物除盐后作为待测样本，使用液相色谱串联质谱检测；
D、在质谱检测结...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨术鹏，李熠，周金慧，丛晓蕾，张金震，杨宇晖，黄京平，金玥，王鹏，赵文，
申请(专利权)人：中国农业科学院蜜蜂研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11