本发明专利技术公开了一种耐热β‑葡萄糖苷酶在低聚龙胆糖制备中的应用，属于基因工程和酶工程领域。本发明专利技术将来源于Thermotoga sp.KOL6的β‑葡萄糖苷酶TSBGl的基因以Bacillus subtilis WSH11为表达宿主，实现tsbgl基因在枯草芽孢杆菌中的高效表达。所述β‑葡萄糖苷酶TSBGl的最适温度为90℃，最适pH为6.0，在90℃下具有较高的热稳定性。将所述β‑葡萄糖苷酶添加至以1200g/L葡萄糖为底物的反应体系中，在pH6.0，90℃下进行酶反应，低聚龙胆糖的产量达到178.2g/L。此酶适合食品等工业应用的需要，可用于低聚龙胆糖的工业化生产。
【技术实现步骤摘要】
一种耐热β-葡萄糖苷酶在低聚龙胆糖制备中的应用
本专利技术涉及一种耐热β-葡萄糖苷酶在低聚龙胆糖制备中的应用，属于基因工程和酶工程领域。
技术介绍
β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)是能够特异性的水解非还原末端的β-D-葡萄糖苷键释放葡萄糖和相应配基的一类糖苷水解酶(Glycosidehydrolysase,，GH)。β-葡萄糖苷酶广泛存在于生物体内并在其中发挥重要的作用，根据其氨基酸序列特征差异，主要分布于GH1、GH3、GH5、GH9、GH30和GH116六个家族中，其中大多数β-葡萄糖苷酶属于GH1，GH3家族。GH1和GH3家族的β-葡萄糖苷酶在蛋白质折叠，理化性质，催化特性和底物特异性等方面都存在差异。β-葡萄糖苷酶可以应用在各种行业中，例如在生物乙醇行业降解纤维二糖，消除产物抑制作用；作为水解果汁中的风味前体糖苷的增味剂；一部分β-葡萄糖苷酶因其具有的转糖苷能力而具有一定的合成活性，可以很好的替代传统的化学方法，合成稀有寡糖和烷基糖苷等应用于食品和化妆品工业中，其中由β-葡萄糖苷酶产生的低聚龙胆糖可以诱导人体肠道益生菌的生长，对人体有益。低聚龙胆糖是一种新的功能低聚糖，是由两个及以上β-1.6-葡萄苷键连接的葡萄糖组成，主要成分是龙胆二糖及少量的龙胆三糖和四糖。低聚龙胆糖的热量低，用在食品中引起龋齿的风险低，另外还有抑制肿瘤及促进营养吸收和代谢等功能。制取低聚龙胆糖方法较多，早期的研究从龙胆属植物的根、茎中提取，也可以利用还原苦杏仁苯法和酸法水解淀粉后从其副产物中提纯获得；但由于原料、市场价格等的限制，使其难以工业化生产。酶法制备是目前低聚龙胆糖工业化生产的主要途径，其常用的反应条件是在低水活度，高底物浓度下，利用β-葡萄糖苷酶的转糖苷活性合成低聚龙胆糖，其得到的低聚龙胆糖的产量都不高，基本都在50g/L，转化率在8％左右。其中影响低聚龙胆糖产量的两个重要的因素是反应温度和酶的转糖苷活性。低聚龙胆糖的产量会随着温度的增加而增加，其原因主要是底物葡萄糖在较高的温度下溶解度会增加，并且此时作为受体的水分子也会相应减少，促进了转糖苷反应的发生，增加低聚龙胆糖的积累量，同时高温也能够防止杂菌污染，从工业生产的角度，在长时间运作的连续生产系统下，酶的失活现象会更加明显，严重影响生产。所以，天然耐受高温的β-葡萄糖苷酶对工业化生产非常重要。此外，目前大多数研究制备低聚龙胆糖主要使用GH3家族的β-葡萄糖苷酶，对GH1家族的β-葡萄糖苷酶研究甚少，GH1家族的β-葡萄糖苷酶在低聚龙胆糖制备中的应用前景还有待开发。
技术实现思路
本专利技术提供了一种编码β-葡萄糖苷酶TSBGl的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述β-葡萄糖苷酶TSBGl的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术提供了一种载体，所述载体携带编码β-葡萄糖苷酶TSBGl的基因。在本专利技术的一种实施方式中，所述载体的出发载体为表达载体pBSMμL3，载体序列记载于公布号为CN107058205A的专利中。本专利技术提供了一种重组菌，所述重组菌以枯草芽孢杆菌为表达宿主，表达氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的β-葡萄糖苷酶TSBGl。在本专利技术的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌为BacillussubtilisWSH11，记载于公布号为CN108102997A的专利中。本专利技术提供了一种生产β-葡萄糖苷酶的方法，所述方法的具体步骤为：(1)将所述重组菌在35～40℃培养2～5h，得到菌液；(2)将菌液在2500～3500rpm离心3～6min，去除60～90％体积的上清，将剩余10～40％体积的上清涂布于LB平板上，35～40℃培养箱培养10～16h；(3)在LB平板上挑取单菌落至LB液体培养基中培养7～11h后，取2～6mL培养液转接到100mLTB培养基中，35～40℃培养1.5～3h，再30～34℃培养45～50h；(4)培养结束后，将培养得到的菌液在7000～9000rpm离心15～25min收集菌体；(5)向菌体中加入45～55mL的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，重悬菌体；(6)使用高压匀浆机破壁，9000～12000rpm离心15～25min后，收集破壁上清液即为粗酶液。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(2)和(3)培养基中的含有5～15μg/mL的四环素。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(5)中柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的浓度为40～60mM，pH为5.0～7.0。本专利技术提供了一种提高低聚龙胆糖产量的方法，所述方法是将所述重组菌发酵得到的β-葡萄糖苷酶在以葡萄糖为底物的体系中反应得到反应液，将反应液纯化后得到低聚龙胆糖。在本专利技术的一种实施方式中，所述β-葡萄糖苷酶的加酶量为300～700U/g。在本专利技术的一种实施方式中，所述β-葡萄糖苷酶的加酶量为400～600U/g。在本专利技术的一种实施方式中，所述葡萄糖浓度为800～1500g/L。在本专利技术的一种实施方式中，所述葡萄糖浓度为1000～1300g/L。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法是在60～100℃下进行反应20～30h。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法是在80～100℃下进行反应22～25h。本专利技术还保护所述基因在食品和化妆品领域制备低聚龙胆糖中的应用。本专利技术还保护所述载体pBSMμL3-tsbgl在食品和化妆品领域制备低聚龙胆糖中的应用。本专利技术还保护所述生产β-葡萄糖苷酶的方法在食品和化妆品领域制备低聚龙胆糖中的应用。本专利技术还保护所述提高低聚龙胆糖产量的方法在食品和化妆品领域制备低聚龙胆糖中的应用。本专利技术还保护所述重组菌在食品和化妆品领域制备低聚龙胆糖中的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术提供了β-葡萄糖苷酶的高效表达方法。由化学法合成编码来源于Thermotogasp.KOL6的β-葡萄糖苷酶TSBGl的核苷酸序列，以穿梭质粒pBSMμL3为表达载体，以BacillussubtilisWSH11为表达宿主，实现了tsbgl基因在枯草芽孢杆菌中的高效表达；β-葡萄糖苷酶TSBGl的最适温度为90-100℃，最适pH为6.0，在90℃下具有较高的热稳定性。β-葡萄糖苷酶TSBGl可以利用葡萄糖并转化生成低聚龙胆糖，尤其能够在1200g/L葡萄糖的高浓度条件下利用葡萄糖进行生产，此时低聚龙胆糖的产量能达到178.2g/L，为β-葡萄糖苷酶法合成低聚龙胆糖的最高产量。因此此酶适合食品、医药等工业应用的需要，能由于低聚龙胆糖的工业化生产。附图说明图1是tsbgl基因表达载体的构建过程。图2是β-葡萄糖苷酶纯化前后的电泳图；M为marker，泳道1为纯化前的β-葡萄糖苷酶TSBGl粗酶液，泳道2为纯化后的β-葡萄糖苷酶TSBGl纯酶。图3是不同温度下β-葡萄糖苷酶的相对酶活。图4是不同pH下β-葡萄糖苷酶的相对酶活本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种编码β-葡萄糖苷酶的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。/n
【技术特征摘要】
1.一种编码β-葡萄糖苷酶的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。
2.携带权利要求1所述基因的载体。
3.根据权利要求2所述的载体，其特征在于，所述载体为pBSMμL3。
4.一种重组菌，其特征在于，所述重组菌以枯草芽孢杆菌为表达宿主，表达氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的β-葡萄糖苷酶，或含有权利要求2或3所述载体。
5.一种生产β-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于，所述方法是利用权利要求4所述重组菌发酵产酶。
6.一种提高低聚龙胆糖产量的方法，其特征在于，利用权利...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴敬，夏伟，盛玲玲，黄燕，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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