杨树功能着丝粒组蛋白CENH3的抗原多肽及其应用制造技术

本发明专利技术公开杨树功能着丝粒组蛋白CENH3的抗原多肽及其应用，属于生物信息学和分子细胞遗传学领域。该发明专利技术主要包括：筛选毛果杨CENH3蛋白特异的一段氨基酸序列并人工合成多肽，用该多肽免疫新西兰兔，制备抗血清，亲和纯化后得到CENH3蛋白抗体；抗体通过免疫荧光检测、ChIP‑FISH进行特异性验证，证明了该抗体可以准确识别功能着丝粒。该抗体可以在杨属树种中通用，不仅可以准确标记杨树功能着丝粒的位置，也为开展杨树着丝粒的结构、功能及进化研究奠定基础。本发明专利技术在杨树分子细胞遗传学、基因组学及表观组学等研究领域具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
杨树功能着丝粒组蛋白CENH3的抗原多肽及其应用
本专利技术属于生物信息学及分子细胞遗传学领域，具体而言，涉及杨树功能着丝粒组蛋白CENH3的抗原多肽及其应用。
技术介绍
着丝粒是真核生物细胞有丝分裂和减数分裂时，保障染色体稳定并正确分离的一个重要功能元件。着丝粒DNA由于含有大量的高度重复序列而加大了序列测定及分析的难度。快速发展的分子生物学技术、生物信息学分析方法及分子细胞遗传学技术在着丝粒研究中的综合运用，尤其是伴随着染色质免疫共沉淀技术(ChromatinImmunoprecipitation，ChIP)和高通量测序技术的应用，加速了人们对着丝粒结构、功能和进化关系的认识(樊起傅等，2017)。着丝粒结构的一个显著特点是，该区域的组蛋白H3变异为CENH3(在哺乳动物中称作CENP-A)(Vafaetal.,1997)。CENH3蛋白是功能着丝粒的标志蛋白。目前主流研究植物着丝粒的核心实验流程是：首先制备能够识别功能着丝粒组蛋白CENH3的特异性抗体，然后通过ChIP技术富集着丝粒DNA，再利用高通量测序对富集的DNA进行测序分析(Szalkowskietal.,2011)，最后结合荧光原位杂交(Fluorescenceinsituhybridization,FISH)技术进行验证。利用该流程已成功进行了玉米(Wangetal.,2014)、紫云英(Teketal.,2011)、马铃薯(Gongetal.,2012；Zhangetal.,2014)、棉花(Hanetal.,2016)、莲藕(Zhuetal.,2016)、短柄草(Lietal.,2018)等物种的着丝粒研究，取得了一系列重大研究成果。然而，已开展过着丝粒相关研究的植物种类多集中在草本植物，多年生林木还未见相关报道。杨树由于其自身的生物学特性及重要地位而成为林木研究的模式树种。2006年，美国科学杂志报道了毛果杨的全基因组测序结果(Tuskanetal.,2006)，胡杨、新疆杨的基因组测序结果也相继发表(Maetal.,2013；Maetal.,2019)。但杨树着丝粒含有大量的高度重复序列，这加大了着丝粒序列组装的难度，现有杨树基因组着丝粒的序列信息仍需完善。因此，迫切需要制备能够识别杨树功能着丝粒组蛋白CENH3的特异性抗体。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述问题，本专利技术所要解决的技术问题在于提供杨树功能着丝粒组蛋白CENH3的抗原多肽，本专利技术所要解决的另一技术问题在于杨树功能着丝粒组蛋白CENH3的抗原多肽在杨属树种中的应用，为开展杨树着丝粒的结构、功能及进化研究奠定基础。为了解决上述问题，本专利技术所采用的技术方案如下：杨树功能着丝粒组蛋白CENH3的抗原多肽，其氨基酸序列为MARTKHPVARKRARSPKRSD。上述抗原多肽是根据毛果杨功能着丝粒组蛋白CENH3氨基酸序列N端的一段特异序列合成的一条多肽。进一步的，所述杨树功能着丝粒组蛋白CENH3的抗原多肽在杨属树种中的应用。进一步的，所述抗原多肽用于制备抗体。一种制备上述抗体的方法：将抗原多肽偶联到蛋白载体上，常规免疫新西兰兔，4免后从兔颈动脉取血收集血清，血清过抗原亲和柱后收集兔源多克隆抗体。一种验证上述抗体的方法，包括免疫荧光检测或ChIP-FISH。上述验证抗体的方法，若所述方法为免疫荧光检测，则所述方法包括如下步骤：根尖固定、染色体制片、一抗孵育、二抗孵育、封片、镜检。上述验证抗体的方法，若所述方法为ChIP-FISH，则所述方法包括如下步骤：杨树细胞核提取及纯化、染色质酶切及检验、染色质预处理、抗体孵育、rProteinA琼脂糖珠子的清洗和孵育、抗体染色质复合物的洗脱、提取ChIP-DNA、探针制备、制片变性及杂交、清洗制片、抗体孵育、清洗制片、DAPI套染、镜检。本专利技术具有有益效果：运用本专利技术公开的20个特异氨基酸序列人工合成抗原多肽，用该多肽免疫新西兰兔，获得CENH3蛋白抗体。制备的抗体通过免疫荧光检测、ChIP-FISH进行特异性验证，证明了该抗体可以准确识别功能着丝粒。该抗体可以在杨属树种中通用，不仅可以准确标记杨树功能着丝粒的位置，也为开展杨树着丝粒的结构、功能及进化研究奠定基础。本专利技术在杨树分子细胞遗传学、基因组学及表观组学等研究领域具有广阔的应用前景。附图说明图1为杨树CENH3的免疫检测及ChIP-FISH结果图。a为杨树的中期染色体；b中红色为CENH3的信号，可见CENH3信号集中在中期染色体的着丝粒位置；c中绿色为ChIPDNA的信号；d为a、b、c合成后的结果，可见CENH3的信号与ChIPDNA的主信号重合，说明ChIPDNA来自着丝粒的DNA，该DNA可以用于下一步测序分析。标尺＝10μm。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进一步进行描述。实施例中没有注明的温度均为室温，没有注明的试剂均为常规化学试剂。实施例1：获取毛果杨着丝粒组蛋白CENH3的氨基酸序列首先在毛果杨基因组数据库中搜索到一个与编码拟南芥CENH3蛋白基因(At1g01370HTR12)同源的基因Potri.014G096400.1，即毛果杨的CENH3蛋白基因，从而获得该基因的氨基酸序列，该基因位于毛果杨的14号染色体且在毛果杨中为单拷贝。通过对不同物种的CENH3蛋白的氨基酸序列进行生物信息学分析，其中包括毛果杨、拟南芥、水稻以及玉米。结果发现毛果杨CENH3蛋白的氨基酸序列与水稻的相似度为54％，与玉米的相似度为53％，与拟南芥的相似度最高为60％。不同物种CENH3蛋白的氨基酸序列在N端变化很大但在C端则比较保守。实施例2：制备杨树着丝粒组蛋白CENH3抗体选择毛果杨着丝粒组蛋白CENH3蛋白N端的20个特异氨基酸序列，具体序列为MARTKHPVARKRARSPKRSD，依据该序列人工合成多肽，作为抗原。将合成的多肽偶联到蛋白载体上，然后常规免疫新西兰兔，4免后从兔颈动脉取血收集血清，血清过抗原亲和柱后收集兔源多克隆抗体，抗体纯度90％，抗体浓度为0.4mg/ml，将抗体分装后，-20℃保存。实施例3：抗体免疫荧光检测免疫荧光检测是对所制备抗体特异性的细胞学检验，因为抗原与抗体反应具有高度的特异性，所以通过免疫荧光检测可以判断所制备CENH3抗体的质量。实验流程如下：(1)根尖固定：选取杨树生长旺盛的根尖，用4％(w/v)的多聚甲醛固定15min，然后用1×PBS缓冲液润洗3遍，每遍5min。(2)染色体制片：1)将根尖转移到干净的载玻片上；2)用双面刀片将根尖分生组织切下；3)向载玻片上加入10μL1×PBS；4)轻轻盖上盖玻片，用解剖针敲击盖玻片使根尖分生组织充分散开；5)将载玻片泡入盛有1×PBS的染缸中，泡掉盖玻片，取出制片气干备用。(3)一抗孵育：每张制片加大约100μL一抗孵育液，孵育液组成为：100μL1×TNB+3μLCENH3抗体，盖本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.杨树功能着丝粒组蛋白CENH3的抗原多肽，其特征在于，其氨基酸序列为MARTKHPVARKRARSPKRSD。/n

【技术特征摘要】
1.杨树功能着丝粒组蛋白CENH3的抗原多肽，其特征在于，其氨基酸序列为MARTKHPVARKRARSPKRSD。


2.权利要求1所述的杨树功能着丝粒组蛋白CENH3的抗原多肽，其特征在于，所述抗原多肽是根据毛果杨功能着丝粒组蛋白CENH3氨基酸序列N端的一段特异序列合成的一条多肽。


3.权利要求1所述的杨树功能着丝粒组蛋白CENH3的抗原多肽在杨属树种中的应用。


4.权利要求1所述的抗原多肽用于制备抗体。


5.一种制备权4所述的抗体的方法，其特征在于，步骤如下：将抗原多肽偶联到蛋白载体上，常规免疫新西兰兔，4免后从兔颈动脉取血收集血清，血清过抗原亲和柱后收集兔源多...

【专利技术属性】
技术研发人员：席梦利，宁仪杭，辛昊阳，刘光欣，赵乙琏，尚大鑫，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32