一种HA阻断剂的制备方法、抗体检测系统技术方案

本发明专利技术属于生物医学技术领域，公开了一种HA阻断剂的制备方法、抗体检测系统，利用浓度为33％‑50％的硫酸铵纯化抗体；在得到的纯化抗体中加入戊二醛交联；透析完成后回收抗体并保存；将样品、检测微球、异嗜性抗体干扰指示微球和标记可检测信号的第二抗体混合，形成一反应体系；检测反应体系中第二抗体‑抗原‑第一抗体‑微球四元复合物中微球上的可检测信号，并与标准值或标准曲线比较，确定反应体系中目标抗原的存在与否和/或数量。本发明专利技术制备的HA阻断剂抗干扰能力强，完全消除HA干扰，不会对免疫检验产生干扰，有效减少假阳性发生率，提高免疫检验的准确度及精准率；本发明专利技术的制备方法简单，容易控制，成本低。

【技术实现步骤摘要】
一种HA阻断剂的制备方法、抗体检测系统
本专利技术属于生物医学
，尤其涉及一种HA阻断剂的制备方法、抗体检测系统。
技术介绍
目前，最接近的现有技术：阻断剂，也叫受体拮抗剂，指能与受体结合，并能阻止激动剂产生效应的一类配体物质。拮抗剂对相应受体有亲和性，但没有效能，从而抑制了激动剂对受体的作用。拮抗剂可以结合受体的活性位点，也可以结合别构位点，甚至单独结合通常没有生物调节作用的位点来达到效果。拮抗剂和受体结合性质不同，所以结合时间有长有短，结合的可逆性也有不同。拮抗剂分为竞争性拮抗剂和非竞争性拮抗剂等类型。大部分药物拮抗剂都与内源性配体或底物竞争受体结合位点来达到效果。受体是可被配体结合而激活的大型蛋白质分子。受体可以结合在细胞膜上，也可存在于细胞内部，比如在细胞核或线粒体中。受体在活性位点与配体以非共价键结合，一个受体上可以有多个结合不同配体的位点。配体和受体在活性位点或别构位点结合后，都可以调节受体的活性。拮抗剂可以通过结合活性位点、别构位点，或者单独结合通常不参与生物调节的位点来产生效果。血清中的易嗜性抗体(HA)已被证实导致免疫检验的假阳性或是假阴性干扰，在免疫检测结合物中加入阻断剂能够消除HA的干扰。但是，在进行抗体检测中，由于标本中HA的来源是未知的，不能够准确的针对HA的结合位点进行操作，目前尚未有一个完全消除HA干扰的阻断剂。现有专利CN201811323185.4异嗜性抗体阻断剂HBR-6及其制备方法，包括其可变区的氨基酸序列和核苷酸序列，其中，重链的3个互补决定区CDR序列分别为，CDR1：Phe-Thr-Ala-Asp-Thr-Ser-Ser，CDR2：Glu-Asp-Asp-Pro，CDR3：Val-Leu-Asp-Ser-Asp-Gly-Ser-Tyr；轻链的3个互补决定区CDR序列分别为，CDR1：Asn-Ile-Pro-Lys-Leu-Leu-Ile-Tyr，CDR2：Ile-Val-Met-Thr，CDR3：Gln-Gly-Glu-Asp-Ile-Ala-Thr-Tyr-Arg，制备的异嗜性抗体阻断剂亲和性不好，抗干扰能力不强，不适用于大规模工业化生产。现有专利CN201811323396.8异嗜性抗体阻断剂HBT-1及其制备方法，包括其可变区的氨基酸序列和核苷酸序列，其中，重链的3个互补决定区CDR序列分别为，CDR1：Val-Gln-Ser-Ser-Ile-Thr，CDR2：Gln-Asp-Asp-Tyr-Ala-Tyr-Thr-Leu-Tyr，CDR3：Val-Tyr-Lys-Leu；轻链的3个互补决定区CDR序列分别为，CDR1：Gly-Asp-Val-Leu-Ser-Lys-Ser-Cys，CDR2：Lys-Asp-Arg-Phe，CDR3：His-Ile-Ile-Ser-Thr-Ser。制备的抗体亲和性不佳，且工艺复杂，工艺参数难以精准控制。综上所述，现有技术存在的问题是：现有的HA阻断剂亲和性不高，无法实现完全消除HA干扰，会对免疫检测结果产生影响；HA阻断剂的制备工艺复杂，难以推广使用。解决上述技术问题的难度：目前市场上已经有商品化的HA阻断剂如：IIR、NS-ABT、Heteroblock、MAB33及polyMAB33，其亲和性较差，与HA结合实现减少干扰的效果并不显著，导致错误结果出现；另外，现有的HA阻断剂的制备方法复杂，不适合规模化生产，难以推广使用。解决上述技术问题的意义：解决上述问题后，HA阻断剂能够完全消除HA干扰，避免残留的HA与动物免疫球蛋白的片段结合对实验产生干扰，样本检测的准确性提高；制备方法的改进能够降低HA阻断剂制备的复杂程度，便于推广使用。制备的HA阻断剂超越传统阻断的方法，能阻断更多假阳性；并且其应用范围广，可阻断抗所有种属(anti-rabbit，anti-goat，anti-sheep，andanti-mouse)，作为通用试剂使用，为检测提供更多便利。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种HA阻断剂的制备方法、抗体检测系统。本专利技术是这样实现的，一种HA阻断剂的制备方法，所述HA阻断剂的制备方法包括以下步骤：第一步，将沉淀用原两倍腹水体积0.01MpH7.4的磷酸缓冲盐溶液重悬溶解，用0.01MpH7.4的磷酸缓冲盐溶液进行透析；弃去上清，解透析袋，将抗体转移至烧杯，在搅拌状态下用量筒倒入原腹水体积的饱和硫酸铵溶液，硫酸铵饱和度为33％；搅拌，混匀分装入离心杯，配平，离心，弃去上清，得到纯化抗体；第二步，将得到的抗体倒入烧杯中，冰浴；将冰浴放在在磁力搅拌器上，搅拌的同时加入25％戊二醛至终浓度为0.4mg/ml；第三步，慢速滤纸过滤，使用紫外分光光度计OD280nm检测抗体浓度，用PBS缓冲液稀释，加入甘油，再加入Proclin300，保存；第四步，将HBR稀释液滴加到待测试的含有HA样本的培养基中，每孔中加入HBR稀释液100uL；在空气95％、二氧化碳5％，湿度为70％-80％，温度37摄氏度的环境下进行培养；培养时间为2-3小时；将样品、检测微球、异嗜性抗体干扰指示微球和标记可检测信号的第二抗体混合，形成一反应体系；检测反应体系中第二抗体-抗原-第一抗体-微球四元复合物中微球上的可检测信号，并与标准值或标准曲线比较，确定反应体系中目标抗原的存在与否和/或数量。进一步，所述第一步中硫酸铵纯化抗体具体包括以下步骤：步骤一，将冷冻的腹水在无菌环境下37℃温浴溶解，用脱脂纱布过滤，量取过滤后的腹水体积，加入等体积0.01MpH7.4的磷酸缓冲盐溶液，混匀；步骤二，在1份腹水中加入1/10份pH8.0的Tris-HCl，温和搅拌；逐渐滴加硫酸铵溶液至饱和度为50％；搅拌1小时，10000r/min，4℃离心20分钟后去除上清，用等体积的硫酸铵重悬沉淀两次后再次离心，并去除上清；步骤三，将得到的沉淀用原两倍腹水体积0.01MpH7.4的磷酸缓冲盐溶液重悬溶解，用0.01MpH7.4的磷酸缓冲盐溶液进行透析，期间换液三次，换液时间不少于4小时；步骤四，弃去上清，解透析袋，将抗体转移至烧杯，在搅拌状态下用量筒匀速倒入原腹水体积的饱和硫酸铵溶液，此时硫酸铵饱和度为33％；搅拌1小时，混匀分装入离心杯，配平，10000r/min，4℃离心20分钟，弃去上清。进一步，所述步骤四之后还需进行：将收集到的沉淀用原腹水体积1/2的0.01MpH7.4磷酸缓冲盐溶液溶解，用0.01MpH7.4磷酸缓冲盐溶液进行透析，期间换液3次，换液时间不少于4小时；收集抗体，观察是否有沉淀：如有沉淀，用快速滤纸过滤去除沉淀，量取抗体体积；如无沉淀，直接量取抗体体积，轻轻混匀抗体，使用微量紫外分光光度计测定A280nm的蛋白含量，并记录测量用0.01MpH7.4磷酸缓冲盐溶液稀释至17mg/ml，使用微量紫外分光光度计在A280模式测定抗体浓度，并记录测量结果。进一步，所述第二步中戊二醛交联具体包括以下步骤：步骤一，将得到的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种HA阻断剂的制备方法，其特征在于，所述HA阻断剂的制备方法包括以下步骤：/n第一步，将沉淀用原两倍腹水体积0.01MpH7.4的磷酸缓冲盐溶液重悬溶解，用0.01MpH7.4的磷酸缓冲盐溶液进行透析；弃去上清，解透析袋，将抗体转移至烧杯，在搅拌状态下用量筒倒入原腹水体积的饱和硫酸铵溶液，硫酸铵饱和度为33％；搅拌，混匀分装入离心杯，配平，离心，弃去上清，得到纯化抗体；/n第二步，将得到的抗体倒入烧杯中，冰浴；将冰浴放在在磁力搅拌器上，搅拌的同时加入25％戊二醛至终浓度为0.4mg/ml；/n第三步，慢速滤纸过滤，使用紫外分光光度计OD280nm检测抗体浓度，用PBS缓冲液稀释，加入甘油，再加入Proclin300，保存；/n第四步，将HBR稀释液滴加到待测试的含有HA样本的培养基中，每孔中加入HBR稀释液100uL；在空气95％、二氧化碳5％，湿度为70％-80％，温度37摄氏度的环境下进行培养；培养时间为2-3小时；将样品、检测微球、异嗜性抗体干扰指示微球和标记可检测信号的第二抗体混合，形成一反应体系；检测反应体系中第二抗体-抗原-第一抗体-微球四元复合物中微球上的可检测信号，并与标准值或标准曲线比较，确定反应体系中目标抗原的存在与否和/或数量。/n...

【技术特征摘要】
1.一种HA阻断剂的制备方法，其特征在于，所述HA阻断剂的制备方法包括以下步骤：
第一步，将沉淀用原两倍腹水体积0.01MpH7.4的磷酸缓冲盐溶液重悬溶解，用0.01MpH7.4的磷酸缓冲盐溶液进行透析；弃去上清，解透析袋，将抗体转移至烧杯，在搅拌状态下用量筒倒入原腹水体积的饱和硫酸铵溶液，硫酸铵饱和度为33％；搅拌，混匀分装入离心杯，配平，离心，弃去上清，得到纯化抗体；
第二步，将得到的抗体倒入烧杯中，冰浴；将冰浴放在在磁力搅拌器上，搅拌的同时加入25％戊二醛至终浓度为0.4mg/ml；
第三步，慢速滤纸过滤，使用紫外分光光度计OD280nm检测抗体浓度，用PBS缓冲液稀释，加入甘油，再加入Proclin300，保存；
第四步，将HBR稀释液滴加到待测试的含有HA样本的培养基中，每孔中加入HBR稀释液100uL；在空气95％、二氧化碳5％，湿度为70％-80％，温度37摄氏度的环境下进行培养；培养时间为2-3小时；将样品、检测微球、异嗜性抗体干扰指示微球和标记可检测信号的第二抗体混合，形成一反应体系；检测反应体系中第二抗体-抗原-第一抗体-微球四元复合物中微球上的可检测信号，并与标准值或标准曲线比较，确定反应体系中目标抗原的存在与否和/或数量。


2.如权利要求1所述的HA阻断剂的制备方法，其特征在于，所述第一步中硫酸铵纯化抗体具体包括以下步骤：
步骤一，将冷冻的腹水在无菌环境下37℃温浴溶解，用脱脂纱布过滤，量取过滤后的腹水体积，加入等体积0.01MpH7.4的磷酸缓冲盐溶液，混匀；
步骤二，在1份腹水中加入1/10份pH8.0的Tris-HCl，温和搅拌；逐渐滴加硫酸铵溶液至饱和度为50％；搅拌1小时，10000r/min，4℃离心20分钟后去除上清，用等体积的硫酸铵重悬沉淀两次后再次离心，并去除上清；
步骤三，将得到的沉淀用原两倍腹水体积0.01MpH7.4的磷酸缓冲盐溶液重悬溶解，用0.01MpH7.4的磷酸缓冲盐溶液进行透析，期间换液三次，换液时间不少于4小时；
步骤四，弃去上清，解透析袋，将抗体转移至烧杯，在搅拌状态下用量筒匀速倒入原腹水体积的饱和硫酸铵溶液，此时硫酸铵饱和度为33％；搅拌1小时，混匀分装入离心杯，配平，10000r/min，4℃离心20分钟，弃去上清。


3.如权利要求2所述的HA阻断剂的制备方法，其特征在于，所述步骤四之后还需进行：将收集到的沉淀用原腹水体积1/2的0.01MpH7.4磷酸缓冲盐溶液溶解，用0.01MpH7.4磷酸缓冲盐溶液进行透析，期间换液3次，换液时间不少于4小时；收集抗体，观察是否有沉淀：如有沉淀，用快速滤纸过滤去除沉淀，量取抗体体积；如无沉淀，直接量取抗体体积，轻轻混匀抗体，使用微量紫外分光光度计测定A280nm的蛋白含量，并记录测量用0.01MpH7.4磷酸缓冲盐溶液稀释至17mg/ml，使用微量紫外分光光度计在A280模式测定抗体浓度，并记录测量结果。


4.如权利要求1所述的HA阻断剂的制备方法，其特征在于，所述第二步中戊二醛交联具体包括以下步骤：
步骤一，将得到的抗体倒入烧杯中，冰浴1h；将冰浴放在在磁力搅拌器上，保持冰量没过抗体液面，搅拌的同时加入25％戊二醛至终浓度为0.4mg/ml，加入时间为20s；
步骤二，搅拌下加入2M甘氨酸至终浓度为0.01M，搅拌30min；
步骤三，使用0.01MpH7.4磷酸缓冲盐溶液对样品进行透析，期间换液二次，换液时间不少于6小时；
步骤四，解透析袋，样品5500r/min，4℃离心18min，取上清，使用紫外分光光度计测定抗体浓度，并记录测量结果。


5....

【专利技术属性】
技术研发人员：张杰，李永刚，
申请(专利权)人：江苏帆博生物制品有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32