一种临床诊断试剂用卵黄抗体的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种临床诊断试剂用卵黄抗体的制备方法，属于生物抗体制剂领域。本发明专利技术收集合格的鸡蛋卵黄，对鸡蛋卵黄稀释及酸化，再通过加入气相二氧化硅对酸化卵黄液进行彻底脱脂，进一步地通过深层过滤、超滤纯化浓缩、冷冻干燥工艺制备成为冻干的临床诊断试剂用卵黄抗体。该方法生产的冻干卵黄抗体是临床诊断用哺乳动物抗体的优良替代原料，有易溶于水、高灵敏、使用便捷安全的特点。本发明专利技术具有工艺简捷、环境友好，方法易于操作，产品安全性高等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种临床诊断试剂用卵黄抗体的制备方法
本专利技术涉及生物抗体制剂领域，特别是一种临床诊断试剂用卵黄抗体的制备方法。
技术介绍
卵黄抗体IgY是从蛋黄中提取的免疫活性物质，特定抗原免疫鸡后，特异性卵黄抗高浓度蓄积于卵黄中，通过生物技术提取纯化，最终应用于临床诊断试剂。卵黄抗体类似于哺乳动物血清抗体IgG，但是以卵黄作为原料获取卵黄抗体比哺乳动物血清来源抗体具备极大优势。传统的人用诊断试剂抗体原料使用的是哺乳动物原料来源抗体（羊，兔等），需要通过采集血液分离血清后获得，存在主要的问题是：需要相当规模的养殖场所、需要采血获得，不符合动物福利原则、由于和人同属哺乳动物，存在检测交叉因素，造成检测灵敏度及精确度会受到干扰。
技术实现思路
本专利技术需要解决的技术问题是获得抗体比哺乳动物源抗体灵敏度高,获得来源广泛便捷，可灵活扩大生产规模。为解决上述技术问题，本专利技术本专利技术提供了一种临床诊断试剂用卵黄抗体的制备方法，具体步骤如下：第一步：强化免疫，用临床诊断指标免疫原，按照特定程序免疫鸡，鸡所产鸡蛋蓄积特定卵黄抗体；第二步：效价检测，对鸡蛋卵黄进行琼脂双向免疫扩散效价检测，收集合格所产鸡蛋卵黄；第三步：酸化，鸡蛋卵黄用纯化水稀释、酸化，离心脱除大部分脂质；第四步：脱脂，用脱脂技术彻底去除残留脂质；第五步：深层澄清过滤，取出脱脂后物料液中细小颗粒物质；第六步：切向流超滤纯化及浓缩，卵黄抗体得到纯化，同时物料液体积浓缩为纯化水稀释酸化前的水平；第七步：低温真空冷冻干燥，通过设定的程序进行冷冻干燥，卵黄抗体成为冻干粉。优选的：第一步免疫鸡的强化方法为：每间隔7~20天进行强化免疫，按照抗原与佐剂等体积混合，多点注射鸡胸肌或翼下肌肉0.5~1.5ml，每次抗原剂量为10~1000ug/只。优选的，第一步中所述佐剂为弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、天然来源佐剂、油乳佐剂、细胞因子佐剂、微生物佐剂、核酸佐剂、纳米佐剂等。优选的，第二步鸡蛋卵黄抗体效价检测方法为：用0.85%生理盐水加入鸡蛋卵黄液中作梯度稀释，在鸡蛋卵黄检测效价超过1：64，收集鸡蛋，分离鸡蛋卵黄优选的，第三步酸化方法为：按照鸡蛋卵黄与纯化水为1:5~1:9进行稀释，调节pH为5.0~6.0混匀搅拌，4℃静止过夜，分离上清液，取上清液即为酸化卵黄液。优选的，第四步脱脂技术为：在酸化卵黄液中加入质量浓度为1~20g/l的气相二氧化硅混匀后，离心收集上清液，取上清液即为完全脱脂卵黄抗体液。优选的，第五步深层澄清过滤步骤方法为：通过过滤压差为0~4bar的折叠滤芯或膜片过滤完全脱脂卵黄抗体液，取过滤液即为无颗粒澄清卵黄抗体液。优选的，第六步切向流超滤纯化及浓缩步骤方法为：通过过滤压差为0~4bar、孔径为10~50kD的堆叠膜包超滤浓缩无颗粒澄清的卵黄抗体液，取浓缩液即为纯化卵黄抗体液，纯化卵黄抗体液体积为第二步加纯化水稀释前体积。优选的，第七步低温真空冷冻干燥步骤方法为：预冻条件为2-4小时内降至-50~-80℃，维持2~4小时，然后设定每小时升温4~8℃，抽真空状态下冻干，获得白色的卵黄抗体粉末。采用上述后，可以灵活扩大生产规模，产品具有很高的生产量，从而具有很高的经济效益，同时，在相同的免疫情况下，系统发生学距离的差异使鸡抗体在抗高度保守的蛋白质或多肽等方面较哺乳动物抗体优良，具有符合动物权益保护、经济优势、与风湿因子无交叉反应、与人类抗鼠抗体没有交叉反应、无补体系统活性、无异质性凝集素、无蛋白质A、G亲和性。具体实施方式下面以实例应用的方式对本专利技术的技术方案进行完整清晰的描述。实施例11材料1.1抗原C反应蛋白（CRP），购自SIGMA试剂（货号C1617）。1.2免疫用产蛋鸡200日龄商品高产罗曼褐鸡，鸡场内常规饲养。1.3试剂弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂购自SIGMA试剂；盐酸为分析纯，气相二氧化硅购自SIGMA试剂，货号S5130。1.4实验仪器离心机为J6-MI大容量冷冻离心机，过滤装置为Millipore除菌过滤器，超滤装置为MilliporePellicon超滤系统，冻干机为美国Virtis台式BenchTopPro。2方法第一步免疫鸡的强化方法为：抗原初免剂量为10ug/只，每间隔10天进行强化免疫，按照抗原与弗氏完全佐剂（购自SIGMA试剂）等体积混合充分乳化，多点注射鸡胸肌0.5ml，在抗原初免后10天进行第一次强化免疫，抗原剂量为15ug/只，所用佐剂为弗氏不完全佐剂（购自SIGMA试剂）等体积混合充分乳化，多点注射鸡胸肌0.5ml，在第一次强化免疫后10天进行第二次强化免疫，抗原剂量为20ug/只，所用佐剂为弗氏不完全佐剂（购自SIGMA试剂）等体积混合充分乳化，多点注射鸡胸肌0.5ml。第二步鸡蛋卵黄抗体效价检测方法为：用0.85%生理盐水加入鸡蛋卵黄液中作梯度稀释，即稀释度为2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍;在鸡蛋卵黄检测效价超过1：64，收集鸡蛋，分离鸡蛋卵黄。第三步酸化方法为：在鸡蛋卵黄液中加入9倍体积的纯化水，混合均匀后用盐酸缓慢滴加至混合液中，调节pH为5.0~6.0，充分混匀，搅拌匀浆，4℃静置过夜，将鸡蛋卵黄液加入至离心管中，配平完后置于离心机（J6-MI大容量冷冻离心机）中，离心机设置4℃，以10000g离心30分钟后用过滤器（Millipore除菌过滤器）过滤分离上清液，取上清液即为酸化卵黄液。第四步脱脂技术为：在酸化卵黄液中加入质量浓度为2g/l、比表面积为200-400m2/g、加入比例为10%~20%的气相二氧化硅（购自SIGMA试剂，货号S5130）混匀后静置2~4小时，将酸化卵黄液加入至离心管中，配平完后置于离心机（J6-MI大容量冷冻离心机）中，离心机设置4℃，以10000g离心30分钟后用过滤器（Millipore除菌过滤器）过滤分离上清液，取上清液即为完全脱脂卵黄抗体液。第五步深层澄清过滤步骤方法为：依次通过孔径为2.0um、1.2um、0.65um、0.45um、0.22um的折叠囊式过滤器进行深层过滤澄清，分离完全脱脂卵黄抗体液，取澄清液为无颗粒澄清卵黄抗体液。第六步切向流超滤纯化及浓缩步骤方法为：选用超滤膜包孔径为30kD、超滤压力小于4bar、0.5平米超滤膜包的超滤系统（MilliporePellicon超滤系统）对均一澄清卵黄抗体液进行超滤，将浓缩液缩至脱脂前体积，浓缩液即为纯化的卵黄抗体；第七步低温真空冷冻干燥步骤方法为：对纯化完的卵黄抗体浓缩液置于冻干机（美国Virtis台式BenchTopPro）平板内，设定温度梯度降温，2小时内降至-50℃，维持2小时，然后按照每小时升高5℃，冻干的同时抽真空，约需24小时冻干，最后在室温状态下维持5小时，取出本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种临床诊断试剂用卵黄抗体的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：/n第一步：强化免疫，用临床诊断指标免疫原，按照特定程序免疫鸡，鸡所产鸡蛋蓄积特定卵黄抗体；/n第二步：效价检测，对鸡蛋卵黄进行琼脂双向免疫扩散效价检测，收集合格所产鸡蛋卵黄；/n第三步：酸化，鸡蛋卵黄用纯化水稀释、酸化，离心脱除大部分脂质；/n第四步：脱脂，用脱脂技术彻底去除残留脂质；/n第五步：深层澄清过滤，取出脱脂后物料液中细小颗粒物质；/n第六步：切向流超滤纯化及浓缩，卵黄抗体得到纯化，同时物料液体积浓缩为纯化水稀释酸化前的水平；/n第七步：低温真空冷冻干燥，通过设定的程序进行冷冻干燥，卵黄抗体成为冻干粉。/n

【技术特征摘要】
1.一种临床诊断试剂用卵黄抗体的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：
第一步：强化免疫，用临床诊断指标免疫原，按照特定程序免疫鸡，鸡所产鸡蛋蓄积特定卵黄抗体；
第二步：效价检测，对鸡蛋卵黄进行琼脂双向免疫扩散效价检测，收集合格所产鸡蛋卵黄；
第三步：酸化，鸡蛋卵黄用纯化水稀释、酸化，离心脱除大部分脂质；
第四步：脱脂，用脱脂技术彻底去除残留脂质；
第五步：深层澄清过滤，取出脱脂后物料液中细小颗粒物质；
第六步：切向流超滤纯化及浓缩，卵黄抗体得到纯化，同时物料液体积浓缩为纯化水稀释酸化前的水平；
第七步：低温真空冷冻干燥，通过设定的程序进行冷冻干燥，卵黄抗体成为冻干粉。


2.按照权利要求1所述的一种临床诊断试剂用卵黄抗体的制备方法，其特征在于：所述第一步免疫鸡的强化方法为：每间隔7~20天进行强化免疫，按照抗原与佐剂等体积混合，多点注射鸡胸肌或翼下肌肉0.5~1.5ml，每次抗原剂量为10~1000ug/只。


3.按照权利要求2所述的一种临床诊断试剂用卵黄抗体的制备方法，其特征在于：所述第一步中所述佐剂为弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、天然来源佐剂、油乳佐剂、细胞因子佐剂、微生物佐剂、核酸佐剂、纳米佐剂等。


4.按照权利要求1所述的一种临床诊断试剂用卵黄抗体的制备方法，其特征在于：所述第二步鸡蛋卵黄抗体效价检测方法为：用0.85%生理盐水加入鸡蛋卵黄液中作梯度稀释，在鸡蛋卵黄检测效价超过1：...

【专利技术属性】
技术研发人员：王耀，刘文进，
申请(专利权)人：埃格生物科技常州有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32