一种水母胶原蛋白的提取方法技术

本发明专利技术提供了一种水母胶原蛋白的提取方法及应用。海洋生物源性胶原蛋白是一种比哺乳动物胶原蛋白更具优势的生物材料，其抗原性比陆生哺乳动物源性胶原蛋白的抗原性更弱而且容易提取。海洋生物源性胶原蛋白具有更好的生物安全性，不会引起哺乳动物源性疾病和病原体传播风险，不涉及宗教信仰问题且来源充足。本发明专利技术所涉及的水母胶原蛋白的提取方法主要包括脱盐、打浆、脱脂、碱化、酶法提取、离心、盐析、离心、沉淀复溶、碱性溶液透析、纯水透析、冷冻干燥等步骤。所提取的胶原蛋白呈现出白色丝状粉末状并聚集成白色海绵状态固体,水溶性良好，与人体胶原蛋白在组分上有极高的相似度。本发明专利技术制备的水母胶原蛋白可应用于创面修复材料、人工皮肤、美容面膜、化妆品、可植入医疗材料、保健食品等产品领域。

【技术实现步骤摘要】
一种水母胶原蛋白的提取方法
本专利技术涉及一种胶原蛋白的提取方法及应用，具体来说，涉及一种水母来源的胶原蛋白的提取方法。所得的水母胶原蛋白与人体胶原蛋白在组分上有极高的相似度，在医疗、美容、保健等领域具有巨大的应用潜力。1、
技术介绍
目前市面上绝大多数的胶原蛋白产品是从陆生哺乳动物(如牛和猪)的毛皮、肌腱等部位提取的胶原蛋白。然而，近年来陆生哺乳动物传染病如牛海绵状脑病(BSE)、可传播性海绵状脑病(TSE)和口蹄疫(FMD)等的爆发，已增加了人们对使用陆生哺乳动物生物材料产品而致病的担忧。而且由于宗教信仰原因，印度教禁止使用牛源性蛋白，伊斯兰和犹太文化禁止猪胶源性蛋白。另外，陆生哺乳动物蛋白纯化困难且昂贵，因此寻找新型生物胶原蛋白材料，逐步替代陆生哺乳动物源性胶原蛋白材料势在必行。海洋生物源性胶原蛋白是一种比哺乳动物胶原蛋白更具优势的生物材料，有文献报道海洋生物来源的胶原蛋白在伤口愈合应用中表现出更令人满意的生物相容性。其抗原性比陆生哺乳动物源性胶原蛋白的抗原性更弱，且更易提取；并具备较高的水溶解度；更值得一提的是它的生物安全性：海洋生物来源生物材料不会引起动物源性疾病和病原体传播风险；不涉及宗教信仰问题且来源充足。因此，海洋生物来源的胶原蛋白修复材料是一种具有广阔开发前景的生物材料，有待成为更优越的新型修复医疗产品，已引起广大生物研究人员和医疗工作者的关注。此外，当前国内外糖尿病患者数量显著增多，因组织修复异常而引发糖尿病难愈皮肤溃疡创面等严重并发症，导致高截肢率，给患者与家庭带来巨大的经济损失，同时造成国家医疗开支的严重负担；且临床尚缺乏切实有效的治疗方法，极大影响患者生存质量。近年来，动物来源的多种新型生物材料，在创伤修复的治疗中得到广泛应用，展现良好的临床应用前景。例如胶原蛋白，具有良好的生物组织相容性、生物降解安全性、凝血性等多种生物学活性，且低毒、抗原性弱，并可促进细胞生长、诱导创伤修复(WerkmeisterJA,etal,Developmentofmonoclonalantibodiestocollagensforassesinghost-implantinteractions,J.Biomed.Mater.Res.,1989,23,273-283)。胶原蛋白具有的三螺旋结构，可作为组织工程的支架材料，能被宿主同化、吸收，表现出良好的生物相容性；胶原蛋白亦可被胶原酶降解，肽链断裂，螺旋结构破坏，水解片段在体温条件下能进一步降解为寡肽或氨基酸，可以再次被利用或被排出体外，对机体无害(史宏灿等，人工气管组分材料胶原蛋白/羟基磷灰石及聚乙丙交酯在大鼠体内的降解，中国组织工程研究与临床康复，2007，35，7090-7093)。血管内膜损伤后暴露出内膜下胶原，可激活局部凝血过程，因此天然的胶原蛋白是良好的止血剂；胶原蛋白分子大，结构序列重复，机体一般不对其产生慢性排斥反应，由胶原制备的异体组织可以长期植入人体；胶原蛋白用作细胞生长的支架，能诱导上皮细胞、血管内皮细胞等增殖、分化和迁移，在创面愈合的再生与塑形阶段，胶原蛋白和修复细胞的相互作用是重要的生物过程(GelseK.etal，Collagens-structure，function，andbiosynthesis，Adv.DrugDeliv.Rev.，2003，55，1531-1546)。理想的创面敷料应具有以下特点：1、良好的生物相容性；2、良好的亲和性，能均匀、紧密地黏附在创面上；3、有良好的透水、透气功能，使伤口保持适度湿润、微酸、低氧环境；4、阻止细菌侵入和抑菌；5、控制和吸收创面渗液；6、促进肉芽和上皮组织正常生长，促进创面愈合，不留瘢痕；7、具有一定的机械强度、柔软、不易产生变形。随着科学技术的不断进步，对生物材料认识的不断深入，生物技术、化学工艺、临床应用等多学科共同交流探索的不断加强，人们发现以各种先进胶原蛋白制成的创面辅料基本符合上面的所有要求。2、
技术实现思路
本专利技术提供了一种水母胶原蛋白的简易提取方法，主要工艺流程包括脱盐、打浆、脱脂、碱化、酶法提取、离心、盐析、离心、沉淀复溶、碱性溶液透析、纯水透析、冷冻干燥等步骤。所提取的胶原蛋白呈现出白色丝状粉末状并聚集成白色海绵状态固体,水溶性良好，与人体胶原蛋白在组分上有极高的相似度。本专利技术所制得的水母胶原蛋白除了可应用于上述的创面修复领域，还可广泛应用于人工皮肤、美容面膜、化妆品、可植入医疗材料、保健食品等产品领域。3、具体实施方式(水母胶原蛋白的提取方法和检测鉴定)3.1水母的基本组成成分水母富含大量的水和盐，其中含水分最多，占76.21％；盐分占21.73％，固形物仅占2.16％。而蛋白质是占固形物最多的组分，占固形物84.33％；脂肪占固形物0.55％。脂肪虽然含量少，但对胶原的提取有很大影响。脂肪对胶原溶解度影响大，易与胶原蛋白黏连，致使胶原溶解度下降，所以为避免上述情况出现，需要脱脂。碱处理：用于除去大量非胶原蛋白。3.2水母胶原蛋白的提取工艺流程水母胶原蛋白的变性温度比较低，一般在25℃，因此提取及提取前处理一般均在低于15℃的条件下进行。优化提取流程，提高提取效率，防止胶原降解。新鲜水母→预处理：脱盐、打浆、脱脂、碱化→酶法提取(胃蛋白酶)→离心→盐析→离心→沉淀复溶→碱性溶液透析→纯水透析→冷冻干燥3.2.1预处理(1)取新鲜水母，用自来水清洗3次，将污垢、沙粒和水母排泄物清洗干净。于5倍以上体积双蒸水浸泡2天，每2-3小时换水一次。48小时后用，用AgNO3溶液检测浸泡液，检测水中氯离子含量，以无肉眼可见白色混浊为标准。(2)将已经脱盐的水母剪碎，后用搞拌机搅碎成0.1×0.1CM左右小颗粒，并用四层纱布过滤、沥干水分。(3)向沥干水分的水母匀浆中加入5倍体积丙酮(或丁酮)，搅拌均匀。浸泡1天后，从丙酮(或丁酮)中取出样品，双蒸水冲洗至无味，并用四层纱布过滤、沥干水分。(4)向沥干水分的水母匀浆加入5倍体积磷酸氢二钠，搅拌均匀。浸泡2天后，从磷酸氢二钠中取出样品，双蒸水冲洗至中性，并用四层纱布过滤、沥干水分。3.2.2酶法提取(1)向沥干水分的水母匀浆加入含1.5％胃蛋白酶的0.05mmol/l柠檬酸溶液，料液比1:2-1:3。于15℃，摇床摇匀，酶消化提取12小时。后于4℃，13000g，离心30min，并取上清。(2)向上清液加入氯化钠，至浓度为2.0mol/l,充分搞拌后摇床摇8-12小时。后于4℃，13000g，离心30min，取沉淀物，沉淀物用双蒸水溶解。(3)复溶液装入50KD透析袋，先用0.02mol/l磷酸氢二钠透析2天，透析液量为袋内液量的5-10倍，透析过程每8小时更换透析液一次。后用双蒸水透析2天，透析液量为袋内液量的5-10倍，透析过程每8小时更换透析液一次。(4)将透析后的复溶液分装于干燥容器中，冷冻干燥12小时，制备出成品为白色海绵状固体。(5)水母胶原蛋白提取率的计算：将冷冻干燥后的胶原蛋白称本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种水母胶原蛋白的提取方法及应用，其特征在于低于15℃的条件下进行提取工艺流程，包括以下步骤。/n步骤1)：取新鲜水母，用自来水清洗3次，将污垢、沙粒和水母排泄物清洗干净。于5倍以上体积双蒸水浸泡2天，每2-3小时换水一次。48小时后用，用AgNO3溶液检测浸泡液，检测水中氯离子含量，以无肉眼可见白色混浊为标准。/n步骤2)：将已经脱盐的水母剪碎，后用搞拌机搅碎成0.1×0.1CM左右小颗粒，并用四层纱布过滤、沥干水分。/n步骤3)：向步骤2)所得的沥干水分的水母匀浆中加入5倍体积丙酮(或丁酮)，搅拌均匀。浸泡1天后，从丙酮(或丁酮)中取出样品，双蒸水冲洗至无味，并用四层纱布过滤、沥干水分。/n步骤4)：向步骤3)所得的沥干水分的水母匀浆加入5倍体积磷酸氢二钠，搅拌均匀。浸泡2天后，从磷酸氢二钠中取出样品，双蒸水冲洗至中性，并用四层纱布过滤、沥干水分。/n步骤5)：向步骤4)所得的沥干水分的水母匀浆加入含1.5％胃蛋白酶的0.05mmol/l柠檬酸溶液，料液比1:2-1:3。于15℃，摇床摇匀，酶消化提取12小时。后于4℃，13000g，离心30min，并取上清液体。/n步骤6)：向步骤5)所得的上清液加入氯化钠，至浓度为2.0mol/l,充分搞拌后摇床摇8-12小时。后于4℃，13000g，离心30min，取沉淀物，沉淀物用双蒸水溶解。/n步骤7)：把步骤6)所得的复溶液装入50KD透析袋，先用0.02mol/l磷酸氢二钠透析2天，透析液量为袋内液量的5-10倍，透析过程每8小时更换透析液一次。后用双蒸水透析2天，透析液量为袋内液量的5-10倍，透析过程每8小时更换透析液一次。/n步骤8)：将步骤7)所得透析后的复溶液分装于干燥容器中，冷冻干燥12小时，制备出成品水母胶原蛋白，最终成品为白色海绵状固体。/n...

【技术特征摘要】
1.一种水母胶原蛋白的提取方法及应用，其特征在于低于15℃的条件下进行提取工艺流程，包括以下步骤。
步骤1)：取新鲜水母，用自来水清洗3次，将污垢、沙粒和水母排泄物清洗干净。于5倍以上体积双蒸水浸泡2天，每2-3小时换水一次。48小时后用，用AgNO3溶液检测浸泡液，检测水中氯离子含量，以无肉眼可见白色混浊为标准。
步骤2)：将已经脱盐的水母剪碎，后用搞拌机搅碎成0.1×0.1CM左右小颗粒，并用四层纱布过滤、沥干水分。
步骤3)：向步骤2)所得的沥干水分的水母匀浆中加入5倍体积丙酮(或丁酮)，搅拌均匀。浸泡1天后，从丙酮(或丁酮)中取出样品，双蒸水冲洗至无味，并用四层纱布过滤、沥干水分。
步骤4)：向步骤3)所得的沥干水分的水母匀浆加入5倍体积磷酸氢二钠，搅拌均匀。浸泡2天后，从磷酸氢二钠中取出样品，双蒸水冲洗至中性，并用四层纱布过滤、沥干水分。
步骤5)：向步骤4)所得的沥干水分的水母匀浆加入含1.5％胃蛋白酶的0.05mmol/l柠檬酸溶液，料液比1:2-1:3。于15℃，摇床摇匀，酶消化提取12小时。后于4℃，13000g，离心30min，并取上清液体。
步骤6)：向步骤5)所得的上清液加入氯化钠，至浓度为2.0mol/l,充分搞拌后摇床摇8-12小时。后于4℃，13000g，离心30min，取沉淀物，沉淀物用双蒸水溶解。
步骤7)：把步骤6)所得的复溶液装入50KD透析袋，先用0.02mol/l磷酸氢二钠透析2天，透析液量为袋内液量的5-10倍，透析过程每8小时更换透析液一次。后用双蒸水透析2天，透析液量为袋内液量的5-10倍，透析过程每8小时更换透析液一次。
步骤8)：将步骤7)所得透析后的复溶液分装于干燥容器中，冷冻干燥12小时，制备出成品水母胶原蛋白，最终成品为白色海绵状固体。


2.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：张培华，崔立峰，
申请(专利权)人：张培华，崔立峰，
类型：发明
国别省市：广东;44