一种菲律宾蛤仔抗冻蛋白及其提取方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种菲律宾蛤仔抗冻蛋白及其提取方法与应用，属于生物技术领域。所述提取方法包括如下步骤：(1)菲律宾蛤仔于4℃环境中培育后取肉；(2)提取菲律宾蛤仔抗冻蛋白粗提液的提取(3)制备冰壳(4)菲律宾蛤仔抗冻蛋白的纯化(5)收集抗冻蛋白。本发明专利技术所述方法提取方法易于操作，纯化过程简单且用时短，所得产品纯度高，更有利于实际生产，增加了产能，降低了成本。

【技术实现步骤摘要】
一种菲律宾蛤仔抗冻蛋白及其提取方法与应用
本专利技术涉及一种菲律宾蛤仔抗冻蛋白及其提取方法与应用，属于生物

技术介绍
菲律宾蛤仔对低温胁迫是一种积极主动地应激过程。抗冻蛋白(AntifreezeProtein，AFP)是一类能够抑制冰晶生长和重结晶的蛋白质，它能以非依数性形式降低水溶液的冰点而对其熔点影响甚微，这种引起的熔点与冰点的差值称为热滞活性，因而抗冻蛋白亦称为热滞蛋白。抗冻蛋白在植物、海洋鱼类、昆虫和微生物中均有分布，目前没有发现从菲律宾蛤仔提取抗冻蛋白的报道。菲律宾蛤仔(Ruditapesphilippinarum)属软体动物门，双壳纲、帘蛤目、帘蛤科。是广泛生活于中国南北沿海的埋栖贝类，具有重要的经济价值。目前在世界约200万吨的菲律宾蛤仔(Ruditapesphilippinarum)产量中，约90％来自于养殖，且主要来自我国大陆的养殖(Goulletquer,1997)。在中国北方，蛤仔养殖过程中要经历冬季的低温，甚至冰冻，生存环境极差，但仍有菲律宾蛤仔正常越冬，体现了较强的抗寒性，是能够适应中国北方海本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种菲律宾蛤仔抗冻蛋白的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：/n(1)将菲律宾蛤仔于0～4℃环境中培育至少一个月，取菲律宾蛤仔肉，用水清洗后保存备用；/n(2)菲律宾蛤仔抗冻蛋白粗提液的提取：菲律宾蛤仔肉与的缓冲液按1:2.8～3.2(m/v)的比例混合、匀浆，所得匀浆液离心后保留上清液，向上清液中加入水至体积与离心前匀浆液的体积相同，保存备用；/n(3)制备冰壳：在圆底烧瓶中加入去离子水，在液氮-无水乙醇浴或无机盐-水-冰混合浴中匀速旋转圆底烧瓶60～80s，使去离子水在圆底烧瓶内壁形成厚度均匀的冰壳，其中，形成冰壳的去离子水体积为初始去离子水体积的1/3～1/5；将剩余的去离子水倒出，...

【技术特征摘要】
1.一种菲律宾蛤仔抗冻蛋白的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将菲律宾蛤仔于0～4℃环境中培育至少一个月，取菲律宾蛤仔肉，用水清洗后保存备用；
(2)菲律宾蛤仔抗冻蛋白粗提液的提取：菲律宾蛤仔肉与的缓冲液按1:2.8～3.2(m/v)的比例混合、匀浆，所得匀浆液离心后保留上清液，向上清液中加入水至体积与离心前匀浆液的体积相同，保存备用；
(3)制备冰壳：在圆底烧瓶中加入去离子水，在液氮-无水乙醇浴或无机盐-水-冰混合浴中匀速旋转圆底烧瓶60～80s，使去离子水在圆底烧瓶内壁形成厚度均匀的冰壳，其中，形成冰壳的去离子水体积为初始去离子水体积的1/3～1/5；将剩余的去离子水倒出，再次将圆底烧瓶放入液氮-无水乙醇浴中匀速旋转20～40s，使圆底烧瓶内的冰壳完全冻结并形成裂缝；
(4)菲律宾蛤仔抗冻蛋白的纯化：
第一次纯化：将步骤(2)所得粗提液加入到步骤(3)制备的冰壳中，在-1～-1.5℃的低温浴中以50～70rpm/min的速度旋转1～2h，当圆底烧瓶中剩余液体体积为初始体积的一半时，倒出剩余的液体，用缓冲液冲洗冰壳表面，除去冰壳表面的杂质；
第二次纯化：将第一次纯化后的冰壳于室温下融化后，加入体积比为1:4～5的缓冲液和去离子水，然后倒入另一冰壳中，在-0.5～-2℃的低温浴中以50～70rpm/min的速度旋转1～2h，当圆底烧瓶中剩余液体体积为初始体积的一半时，倒出剩余的液体，用缓冲液冲洗冰壳表面，除去冰壳表面的杂质；
第三次纯化：重复一次第二次纯化的步骤；
(5)收集抗冻蛋白：将步骤(4)第三次纯化后所得产物于室温下融化后，用透析袋浓缩至体积为透析前的1/10，浓缩液离心，上清液冷冻干燥，即得抗冻蛋白。


2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(1)所述的菲律宾蛤仔选用规格一致且健康完整的；保存温度为-80～4℃。

【专利技术属性】
技术研发人员：聂鸿涛，李宁，闫喜武，
申请(专利权)人：大连海洋大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21