荧光蛋白及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种荧光蛋白及其制备方法和应用，涉及生物技术领域，本发明专利技术筛选出了一种新型红色大斯托克斯位移的荧光蛋白，它可与绿色荧光蛋白一起在单光子和多光子显微成像中有效的同时被单色光激发进行多色成像，它不仅单体性好，而且光稳定性也得到了较大改善。同时，它可以作为供体与受体荧光素酶结合，在生物体内形成一种新的高灵敏的生物发光共振能量转移系统。在检测细胞内分子间相互作用时，该生物发光共振能量转移系统的动态范围比传统的生物发光共振能量转移系统提高了2.27倍。应用本发明专利技术提供的应该蛋白，提高了BRET系统的效率，提高了利用生物发光共振能量转移系统对检测分子间相互作用的动态范围。

【技术实现步骤摘要】
荧光蛋白及其制备方法和应用
本专利技术涉及生物
，尤其是涉及一种荧光蛋白及其制备方法和应用。
技术介绍
随着后基因组时代的来临，作为生物体结构的重要组成成分和生物性状的体现者，蛋白质研究越来越多的成为生命科学研究的焦点，尤其是在蛋白质-蛋白质相互作用方面。传统的检测蛋白质-蛋白质相互作用的方法有酵母双杂交、免疫共定位、串联亲和纯化、质谱鉴定和免疫共沉淀等，它们都对细胞结构有破坏性。荧光共振能量转移(FRET)和生物发光共振能量转移(BRET)，克服了传统的检测方法的限制，可以在无损细胞的情况下，实时监测细胞内蛋白质-蛋白质间的相互作用。BRET首先发现于海洋生物维多利亚水母中，是一种非辐射的能量从供体到受体的转移过程。BRET有两个融合蛋白，一个融合能量供体荧光素酶，一个融合能量受体荧光蛋白，荧光素酶由加入的底物(如腔肠素等)来激活。当两个融合蛋白发生相互作用，并且距离小于10nm，供体便会发出能量转移到受体；如果不发生作用，则只能检测到供体氧化底物发出的光。生物发光由于其不需要光激发(而荧光需要光激发)，背景低的特点，已成为活体光学成像的重要手段之一。然而较亮的荧光素酶(通过与底物的生化反应而产生光子)不仅量子产率低，而且发射光子的波长较短(激发峰<600nm)，因此限制其在动物体内的应用。基于荧光素酶和荧光蛋白的生物发光共振能量转移(BRET)则很好的解决了上述认为问题。然而，目前基于BRET的生物发光探针中的红色荧光蛋白的量子产率相对较低(<0.4)，而且荧光素酶的发射光谱与荧光蛋白的吸收谱重叠较少，从而导致BRET效率较低。因此，需要找到一种能与目前最亮的荧光素酶在光谱上有高重叠，而且其发射峰在～600nm处的荧光蛋白。现有的满足该条件的荧光蛋白包括CyOFP1或mCyRFP1等。但CyOFP1是一个二聚体，融合性能较差，不利于其应用于构建分子探针，而mCyRFP1的光漂白性差，不利于长时成像。此外，现有的BRET系统效率虽相较于之前已经有所提高，但仍需进一步提升。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提供一种荧光蛋白，以至少缓解现有技术中存在的技术问题之一。本专利技术的第二个目的在于提供一种表达上述荧光蛋白的核酸，可以表达出上述荧光蛋白。本专利技术的第三个目的在于提供一种含有上述核酸的宿主细胞，可用于克隆和制备上述荧光蛋白。本专利技术的第四个目的在于提供一种包含上述荧光蛋白的试剂盒。本专利技术的第五个目的在于提供上述荧光蛋白的生产方法，该方法工艺简单，操作方便，能够准确地得到目的荧光蛋白。本专利技术的第六个目的在于提供上述荧光蛋白的应用。本专利技术提供了一种荧光蛋白，所述荧光蛋白为如下(a)-(c)：(a)由SEQIDNO:1所示的氨基酸序列中N12、R14、Q27、L70、A98、E108或V125位置上至少具有一个氨基酸替换的氨基酸序列所组成；(b)由SEQIDNO:1所示的氨基酸序列中N45位置上的氨基酸替换的氨基酸序列所组成；(c)由SEQIDNO:1所示的氨基酸序列中A165位置上的氨基酸替换的氨基酸序列所组成。进一步地，所述(a)中的氨基酸替换为：N12E、R14T、Q27Y、L70I、A98T、E108V或V125T中的一个或多个；优选地，所述(b)中的氨基酸替换为：N45A；优选地，所述(c)中的氨基酸替换为：A165K。进一步地，所述荧光蛋白为如下(a)-(c)，具有如SEQIDNO:3所示的氨基酸序列：：(a)由SEQIDNO:1所示的氨基酸序列进行N12E、R14T、Q27Y、L70I、A98T、E108V和V125T氨基酸替换的氨基酸序列所组成；(b)由SEQIDNO:1所示的氨基酸序列进行N45A氨基酸替换的氨基酸序列所组成；(c)由SEQIDNO:1所示的氨基酸序列进行A165K氨基酸替换的氨基酸序列所组成。本专利技术还提供了一种核酸，所述核酸编码上述的荧光蛋白。进一步地，所述核酸具有如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。本专利技术还提供了一种载体，所述载体包括上述的核酸。本专利技术还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括上述的核酸或载体。本专利技术还提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包含上述的荧光蛋白。本专利技术还提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括上述的荧光蛋白。本专利技术还提供了一种生物发光共振能量转移系统，所述生物发光共振能量转移系统包括上述的荧光蛋白和受体荧光素酶；优选地，所述受体荧光素酶为Teluc。另外，本专利技术还提供了上述的荧光蛋白在检测细胞内基因表达、蛋白定位、细胞分化的标记或细胞发育的标记中至少一种的应用。本专利技术筛选出了一种新型红色大斯托克斯位移的荧光蛋白，命名为mCyRFP2，它可与绿色荧光蛋白(GFP)一起在单光子和多光子显微成像中有效的同时被单色光激发进行多色成像，它不仅单体性好，而且光稳定性也得到了较大改善。同时，它可以作为供体与受体荧光素酶Teluc结合，在生物体内形成一种新的高灵敏的生物发光共振能量转移系统。在检测细胞内分子间相互作用时，该生物发光共振能量转移系统的动态范围比mNeonGreen和Nluc组成的生物发光共振能量转移系统提高了2.27倍。应用本专利技术提供的应该蛋白，提高了BRET系统的效率，提高了利用生物发光共振能量转移系统对检测分子间相互作用的动态范围。附图说明为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本专利技术实施例1提供的mCyRFP2的激发与发射光谱图；图2为本专利技术实施例2提供的mCyRFP2的单体性鉴定结果图；图3A为本专利技术实施例2提供的表达mCyRFP2的不同亚细胞器的荧光结果图；图3B为本专利技术实施例2提供的mCyRFP2在HeLa细胞中有丝分裂不同阶段的荧光成像图；图4为本专利技术实施例3提供mCyRFP2、CyOFP1、mCyRFP1和mNeonGreen定位于Hela细胞的细胞核时，利用双光子激发所获得的荧光随着双光子的激发而产生衰减的曲线；图5为本专利技术实施例4提供的由Teluc和mCyRFP2所形成的新型BRET系统在检测细胞内分子间经典相互作用模型FRB、FKBP12时所产生的BRET动态范围变化结果图。具体实施方式除非本文另有定义，连同本专利技术使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中，除非另有说明，“或”的使用意味着“和/或”。此外，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种荧光蛋白，其特征在于，所述荧光蛋白为如下(a)-(c)：/n(a)由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中N12、R14、Q27、L70、A98、E108或V125位置上至少具有一个氨基酸替换的氨基酸序列所组成；/n(b)由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中N45位置上的氨基酸替换的氨基酸序列所组成；/n(c)由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中A165位置上的氨基酸替换的氨基酸序列所组成。/n

【技术特征摘要】
1.一种荧光蛋白，其特征在于，所述荧光蛋白为如下(a)-(c)：
(a)由SEQIDNO:1所示的氨基酸序列中N12、R14、Q27、L70、A98、E108或V125位置上至少具有一个氨基酸替换的氨基酸序列所组成；
(b)由SEQIDNO:1所示的氨基酸序列中N45位置上的氨基酸替换的氨基酸序列所组成；
(c)由SEQIDNO:1所示的氨基酸序列中A165位置上的氨基酸替换的氨基酸序列所组成。


2.根据权利要求1所述的荧光蛋白，其特征在于，所述(a)中的氨基酸替换为：N12E、R14T、Q27Y、L70I、A98T、E108V或V125T中的一个或多个；
优选地，所述(b)中的氨基酸替换为：N45A；
优选地，所述(c)中的氨基酸替换为：A165K。


3.根据权利要求2所述的荧光蛋白，其特征在于，所述荧光蛋白为如下(a)-(c)，具有如SEQIDNO:3所示的氨基酸序列：
(a)由SEQIDNO:1所示的氨基酸序列进行N12E、R14T、Q27Y、L70I、A98T、E108V和V125T氨基酸替换的氨基酸序列所组成；
(b)由SEQIDNO:1所示的氨基酸序列进行N...

【专利技术属性】
技术研发人员：储军，张楚秋，郭育奇，邓梦颖，
申请(专利权)人：中国科学院深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44