本发明专利技术涉及一种亲本多肽的变体，其优选为己糖转运蛋白，其中所述变体包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列当与SEQ ID NO:1的氨基酸序列比对时，包含氨基酸N376和T89的替换，所述氨基酸的位置是参照SEQ ID NO:1的氨基酸序列定义的。所述多肽适用于从富含阿拉伯糖的生物质例如玉米秸秆和玉米淀粉生产乙醇。
Peptides with improved arabinose transport specificity
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有改善的阿拉伯糖转运特异性的多肽
本专利技术涉及具有改善的阿拉伯糖转运特异性和降低的葡萄糖转运活性的变体多肽，包含编码所述多肽的核酸序列的重组酵母，以及它们用于生产发酵产物(例如乙醇)的用途。
技术介绍
通过在功能上替代化石燃料来源的化合物，化学品和运输燃料的微生物生产可以促进向可持续、低碳的全球经济过渡。燃料乙醇的总工业产量在2015年达到了约1000亿升，预计将进一步增加。酵母酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)是用于将淀粉来源和蔗糖来源的己糖单元转化为乙醇的已确立的微生物细胞工厂，因为它结合了高乙醇产量和生产率与工艺条件下的稳健性。在酵母菌株改良和对基于玉米淀粉和蔗糖的生物乙醇生产的工艺优化方面的努力已经进一步提高了产品产量和生产率。此外，密集的代谢和进化工程研究已经产生了能够有效发酵戊糖木糖和阿拉伯糖的酵母菌株，从而为基于酵母的从木质纤维素水解物生产‘第二代’生物乙醇铺平了道路。已知己糖转运蛋白Gal2介导阿拉伯糖转运(BeckerJ,BolesE.2003,AmodifiedSaccharomycescerevisiaestrainthatconsumesL-Arabinoseandproducesethanol,ApplEnvironMicrobiol.69:4144-4150)。然而，对各戊糖的亲和力比对各己糖的亲和力低约10至100倍。因此，重组酵母细胞中缺乏专用的木糖或阿拉伯糖转运蛋白限制了共利用糖混合物中的己糖和戊糖的能力，并禁止了高戊糖分解代谢通量。因此，生物质糖的转化可被认为是双阶段的：在第一阶段中发生己糖(葡萄糖)的相对快的转化，而在当己糖已从培养基中耗尽时开始的第二阶段中戊糖发酵开始，但是以比己糖转化速率低得多的速率进行。因此，长期以来都希望表达阿拉伯糖特异性的糖转运蛋白，即没有葡萄糖干扰(阿拉伯糖特异性)并且对阿拉伯糖具有高亲和力，以保持以大致相同水平转化己糖的能力。附图说明图1.使用表达Gal2变体的菌株DS68625在一定范围的D-葡萄糖浓度存在下使用50mM[14C-]L-阿拉伯糖进行的摄取实验：N376T+T89I(空心圆圈)、N376T(实心圆圈)、T89I(空心正方形)和Gal2野生型(实心正方形)。图2.使用表达Gal2变体的菌株DS68625在一定范围的D-葡萄糖浓度存在下使用50mM[14C-]L-阿拉伯糖进行的摄取实验：N376T+T89I(空心圆圈)、N376T(实心圆圈)、T89I(空心正方形)和Gal2野生型(实心正方形)。图3.使用多种浓度的[14C-]L-阿拉伯糖(顶部)或[14C-]D-葡萄糖(底部)进行摄取实验，以确定表达Gal2变体的菌株DS68625的Km和Vmax：T89I(空心圆圈)、N376T+T89I(实心圆圈)、N376T(空心正方形)、Gal2野生型(实心正方形)、N376S(实心菱形)和N376I(空心菱形)。专利技术详述本专利技术的一个目的是提供具有降低的葡萄糖亲和力的新颖变体己糖转运多肽。本专利技术的另一个目的是提供对阿拉伯糖具有高亲和力的新颖变体己糖转运多肽。根据本专利技术实现了这些目的中的一个或多个。在整个说明书和所附权利要求书中，词语“包括”和“包含”将被包含性地解释。也就是说，在上下文允许的情况下，这些词语旨在传达可能包括未具体叙述的其他要素或整数。在本文中不使用数量词修饰时用于指代一个(种)或多于一个(种)(即，一个(种)或至少一个(种))的对象。举例来说，“氨基酸”可以表示一个/种氨基酸或多于一个/种氨基酸。与SEQIDNO:X所示的氨基酸序列进行比对的氨基酸序列(当提及变体多肽时)是指通过合适的方法来比对变体氨基酸序列和SEQIDNO:X所示的氨基酸序列，所述合适的方法允许将这些序列彼此进行比较并鉴定出如果与SEQIDNO:X所示的氨基酸序列比较，在变体的氨基酸序列中存在相同氨基酸(相同位置)、或存在另一种氨基酸(替换)、或存在一个或多个额外的氨基酸(插入或延伸)、或者不存在氨基酸(缺失或截短)的位置。允许比较两个氨基酸序列的合适方法可以是本领域技术人员已知的任何合适的成对序列比对方法，优选全局成对序列比对方法(GlobalPairwiseSequenceAlignmentmethod)。一种优选的全局成对序列比对方法是基于如本文所述的Needleman-Wunsch比对算法(Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.(1970)J.Mol.Biol.48,443-453)的EMBOSSNeedle方法(旨在找到两个序列沿它们的整个长度的最佳比对(包括空位))。在一个实施方式中，使用来自EMBOSS包的NEEDLE程序，使用EBLOSUM62作为替换矩阵，使用为10的空位开放罚分和为0.5的空位延伸罚分，将氨基酸序列与SEQIDNO:x所示的氨基酸序列进行比对。如本文所定义的“酵母”或“酵母细胞”是适用于遗传操纵的酵母，并且其可以以可用于目标产物工业生产的细胞密度进行培养。酵母或酵母细胞可以是在自然界中存在的，或者是源自亲本细胞的遗传操纵或经典诱变后的细胞。如本文所用的术语“控制序列”是指在特定生物体内或体外参与编码序列表达的调控的组分。控制序列的示例是转录起始序列、终止序列、启动子、前导序列、信号肽、前肽(propeptides)、原前肽(prepropeptides)或增强子序列；夏因-达尔加诺序列(Shine-Delgarnosequence)、阻遏物或激活物序列；有效的RNA处理信号，例如剪接和多腺苷酸化信号；稳定化细胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(例如，核糖体结合位点)；增强蛋白质稳定性的序列；以及当期望时，增强蛋白质分泌的序列。术语“培养”是指在营养培养基中并在适合于所述微生物的生长和/或繁殖和/或由所述微生物产生感兴趣的化合物的条件下使所述微生物增殖的方法。这些方法是本领域中已知的。例如，当微生物能够表达/产生感兴趣的化合物时，可以通过在合适的培养基中和允许表达和/或分离感兴趣的化合物的条件下执行实验室或工业发酵罐中的摇瓶培养、小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养微生物。通常，培养将包括主要旨在形成生物质的生长期和主要旨在产生感兴趣的化合物的生产期。生长期和生产期可在某种程度上重叠。合适的营养培养基包含碳源、氮源和另外的化合物(例如无机盐(例如磷酸盐)、微量元素和/或维生素)(参见例如Bennett,J.W.和LaSure,L.编辑，MoreGeneManipulationsinFungi,AcademicPress,CA,1991)，并且可以在需氧或厌氧条件下执行。术语“来源于”也涵盖术语“源自”、“获自”、“能够获自”、“分离自”和“从……形成”，并且通常表示一种指定的材料来源于另一种指定的材料或具有可以参照该另一种指定材料描述的特征。如本文所用，“来源于”微生物的物质(例如，核酸分子或多肽)优选地是指该物质对该微生物而言是天然的。术语“表达”包括本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种亲本多肽的变体，所述变体优选为己糖转运蛋白，其中所述变体包含氨基酸序列，所述氨基酸序列当与SEQ ID NO:1的氨基酸序列比对时，包含对氨基酸N376和T89的替换，所述氨基酸的位置是参照SEQ ID NO:1的氨基酸序列定义的。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171114 EP 17201608.1;20171128 EP 17203961.21.一种亲本多肽的变体，所述变体优选为己糖转运蛋白，其中所述变体包含氨基酸序列，所述氨基酸序列当与SEQIDNO:1的氨基酸序列比对时，包含对氨基酸N376和T89的替换，所述氨基酸的位置是参照SEQIDNO:1的氨基酸序列定义的。
2.根据权利要求1所述的变体，其中所述亲本多肽包含SEQIDNO:1的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的变体，其中氨基酸N376的替换包括N376T、N376C、N376V、N376M、N376L、N376I或N376F中的任一者。
4.根据前述权利要求中任一项所述的变体，其中氨基酸T89的替换包括T89I、T89V、T89L、T89S、T89M或T89F中的任一者。
5.根据前述权利要求中任一项所述的变体，其中氨基酸N376的替换包括N376T、N376S或N376I中的任一者，并且其中氨基酸T89的替换包括T89I。
6.根据前述权利要求中任一项所述的变体，所述变体与所述亲本多肽的氨基酸序列具有至少80％的序列同一性。
7.根据前述权利要求中任一项所述的变体，所述变体是人造多肽。
8.一种编码根据权利要求1至7中任一项所述的变体的核酸序列，优选地其中所述核酸序列是人造的。
9.一种核酸构建体，所述核酸构建体包含与一个或多个控制序列可操作地连接的权利要求8所述的核酸序列，所述一个或多个控制序列能够指导所述多肽变体在合适的细胞中的表达。
10.一种重组表达盒，所述重组表达盒包含权利要求9所述的核酸构建体。
11.一种重组酵母，所述重组酵母包含权利要求8所述的核酸序列，权利要求9所述的核酸构建体，和/或权利要求10所述的表达盒。
12.根据权利要求11所述的重组酵母，所述重组酵母还包含一个或多个编码L-阿拉伯糖异构酶(E.C.5.3.1.4；araA)的基因；一个或多个编码L-核酮糖激酶(EC2.7.1.16；araB)的基...
【专利技术属性】
技术研发人员：安东尼斯·杰罗恩·亚拉恩·范马里斯，雅各布斯·托马斯·普龙克，马尔滕·德克·韦尔霍温，
申请(专利权)人：帝斯曼知识产权资产管理有限公司，
类型：发明
国别省市：荷兰;NL
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