一种靶向NEDD4基因的siRNA核酸脂质体及其用途制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体涉及一种靶向NEDD4基因的siRNA核酸脂质体及其用途。本发明专利技术由阳离子脂质体组分与siRNA结合得到的siRNA核酸脂质体膜与细胞膜相似，表面带正电性，不易被核酸酶降解，能够使负载的siRNA进入细胞靶向性沉默NEDD4基因，达到治疗大肠癌的目的。本发明专利技术进一步验证偏中性的透明质酸HA添加后的siRNA‑HA脂质体加强siRNA脂质体靶向性的同时优化了其稳定性，且透明质酸作为CD44受体细胞可以靶向大肠癌中的CD44细胞，对大肠癌细胞具有沉默效果。本发明专利技术制备工艺简单，成本低，制备的siRNA核酸脂质体粒径较小，具有良好的生物相容性及稳定性，具有NEDD4靶向性，有利于基因药物在体内的靶向运输，实现基因药物体内循环和对NEDD4高表达肿瘤的靶向沉默效果。

【技术实现步骤摘要】
一种靶向NEDD4基因的siRNA核酸脂质体及其用途
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种靶向NEDD4基因的siRNA核酸脂质体及其用途。
技术介绍
结肠直肠癌（CRC）是世界上第三大常见的恶性肿瘤，复发率、病死率极高。如何提高结肠直肠癌的治愈率及减少其复发性，成为亟需解决的问题。目前结肠直肠癌主要的治疗手段为手术治疗（腹腔镜或开腹手术）、单抗治疗、外泌体治疗，鲜有用小核酸技术进行结肠直肠癌的治疗。2001年发现RNA具有基因沉默功能，可以指导互补信使RNA的转录后降解，小干扰RNA（siRNA）为21~23个核苷酸的双链RNA分子，通过在两条siRNA链之一的互补位点诱导mRNA清除来负向调节基因表达，通过敲除涉及疾病发展的特定基因。目前，siRNA可以作为药用活性分子而达到治疗癌症的目的。NEDD4是细胞生存的基本基因，被认为是原癌基因。NEDD4基因是在ENaC中通过WW结构域结合PY模体，介导钠离子通道的下调。现有研究表明NEDD4能泛素化PTEN和ERBB1/2/3/4，导致蛋白质降解和/或改变细胞内定位。在大肠癌中，NEDD4的损耗并不影响PTEN蛋白水平或者PI3K/AKT信号通路，同时PTEN野生型和变异型结肠肿瘤中，NEDD4表达也不存在明显差异，从而证明NEDD4独立于PTEN和PI3K/AKT信号通路促进大肠癌细胞的生长，siRNA沉默NEDD4基因被证明具有治疗结肠直肠癌、大肠癌的效果。siRNA干扰作为一种新型的治疗手段应用于结肠直肠癌及大肠癌的治疗，其具有特异性高，无免疫原性等优点，但由于siRNA具有易被核酸酶降解，表面带负电性，难以通过细胞膜和靶向性差造成siRNA药物使其临床应用较少，目前还没有将siRNA沉默NEDD4基因用于结肠直肠癌、大肠癌等治疗药物中的研究。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术中存在的不足，提供一种靶向NEDD4基因的siRNA核酸脂质体及其用途。本专利技术通过脂质体组分与NEDD4抑制剂的结合形成siRNA核酸脂质体，通过细胞膜从而靶向沉默NEDD4基因，实现了NEDD4靶向药物的制备。制备工艺简单、稳定性好，可提高结肠直肠癌治疗效率，对基因药物用于靶向治疗NEDD4高表达肿瘤的癌症治疗具有重要意义。为实现本专利技术的目的，采用的具体技术方案如下：本专利技术提供了一种靶向NEDD4基因的siRNA核酸脂质体，所述的siRNA核酸脂质体包含脂质体组分和NEDD4抑制剂；在一个具体实施方案中，所述的siRNA核酸脂质体包含脂质体组分和NEDD4抑制剂；所述的脂质体组分包括DOTAP、Chol、DSPC和DSPE-PEG2000；所述NEDD4抑制剂为靶向NEDD4的siRNA，siRNA的正义链为5′-UUCAAUUGCCAUCUGAAGUUUAUCC-3′，反义链为3′-CCUAUUUGAAGUCUACCGUUAACUU-5′。在一个具体实施方案中，所述脂质体组分中DOTAP、Chol、DSPC和DSPE-PEG2000的摩尔比为30~50：35~45：9~11：6~8。在一个具体实施方案中，所述脂质体组分中DOTAP、Chol、DSPC和DSPE-PEG2000的摩尔比为40:40:10:7。在一个具体实施方案中，所述的NEDD4抑制剂中添加有透明质酸HA，所述透明质酸的分子量为7000~9000Da，优选为透明质酸钠。在一个具体实施方案中，所述透明质酸HA添加量与脂质体组分中DOTAP的摩尔比为0.5~1.5:6~10。在一个具体实施方案中，所述透明质酸HA添加量与脂质体组分中DOTAP的摩尔比为1:40。在一个具体实施方案中，本专利技术所述的靶向NEDD4基因的siRNA核酸脂质体中脂质体组分和NEDD4抑制剂siRNA的N/P比为3~5：1。在一个具体实施方案中，优选的脂质体组分和NEDD4抑制剂siRNA的N/P比为4:1.本专利技术还提供了所述的靶向NEDD4基因的siRNA核酸脂质体在制备用于治疗或预防NEDD4基因异常表达引起的疾病中的药物中的用途，所述的疾病为结直肠癌或大肠癌。本专利技术还提供了一种脂质体制剂，其包含上述的靶向NEDD4基因的siRNA核酸脂质体及药学上可接受的载体。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术提供一种靶向NEDD4基因的siRNA核酸脂质体，其由阳离子脂质体组分与NEDD4抑制剂siRNA结合后通过超声或涡旋方式形成siRNA脂质体，透析去除有机溶剂后得到的siRNA核酸脂质体。制备的siRNA核酸脂质体膜与细胞膜相似，表面带正电性，不易被核酸酶降解，能够使负载的siRNA进入细胞靶向性沉默NEDD4基因，达到治疗大肠癌的目的。本专利技术进一步验证偏中性的透明质酸（HA）添加后的siRNA-HA脂质体加强siRNA脂质体靶向性的同时优化了其稳定性，且透明质酸作为CD44受体细胞可以靶向大肠癌周围CD44细胞，在大肠癌中高表达，对大肠癌细胞沉默效果。本专利技术制备工艺简单，成本低，制备的siRNA核酸脂质体粒径较小，具有良好的生物相容性及稳定性，具有NEDD4靶向性，有利于基因药物在体内的靶向运输，赋予基因药物体内循环和对NEDD4高表达肿瘤的精准靶向沉默功能。附图说明图1是实施例3中siRNA脂质体、siRNA-HA脂质体及空白对照组的凝胶电泳阻滞图；图2是实施例4中包封率保留率对比图；图3是施例5中siRNA脂质体细胞存活率对比图；图4是实施例5中siRNA-HA脂质体细胞存活率对比图；图5是siRNA脂质体和siRNA-HA脂质体流式细胞凋亡图。具体实施方式本专利技术公开了一种靶向NEDD4基因的siRNA核酸脂质体，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。下例实施实例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本专利技术方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。试剂及仪器：NEDD4基因的siRNA、NC-siRNA脂质体均购买自广东锐博生物技术有限公司；DOTAP、Chol、DSPC、DSPE-PEG2000均购买自艾韦特医药科技有限公司；RNaseA购买自北京索莱宝生物科技有限公司；透明质酸钠（7000-9000）购买自华熙福瑞达生物医药有限公司；琼脂糖凝胶购买自宝生物工程有限公司，GelRed购买自今生物科技有限公司，MTT购自于GenviewPtyLtd；Lipofectamine™2000购买自美国英杰生命技术有限公司，AnnexinV染色液、AAD染色液均购买自江苏凯基生物技术股份有限公司。实施例1：siRNA脂质体的制备分别配置浓度为0.016mm本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种靶向NEDD4基因的siRNA核酸脂质体，其特征在于，所述的siRNA核酸脂质体包含脂质体组分和NEDD4抑制剂；所述的脂质体组分包括DOTAP、Chol、DSPC和DSPE-PEG2000；所述NEDD4抑制剂为靶向NEDD4的siRNA，siRNA的正义链为5′-UUCAAUUGCCAUCUGAAGUUUAUCC-3′，反义链为3′-CCUAUUUGAAGUCUACCGUUAACUU-5′。/n

【技术特征摘要】
1.一种靶向NEDD4基因的siRNA核酸脂质体，其特征在于，所述的siRNA核酸脂质体包含脂质体组分和NEDD4抑制剂；所述的脂质体组分包括DOTAP、Chol、DSPC和DSPE-PEG2000；所述NEDD4抑制剂为靶向NEDD4的siRNA，siRNA的正义链为5′-UUCAAUUGCCAUCUGAAGUUUAUCC-3′，反义链为3′-CCUAUUUGAAGUCUACCGUUAACUU-5′。


2.根据权利要求1所述的siRNA核酸脂质体，其特征在于，所述脂质体组分中DOTAP、Chol、DSPC和DSPE-PEG2000的摩尔比为30~50：35~45：9~11：6~8。


3.根据权利要求2所述的脂质体，其特征在于，所述脂质体组分中DOTAP、Chol、DSPC和DSPE-PEG2000的摩尔比为40:40:10:7。


4.根据权利要求1所述的脂质体，其特征在于，所述的NEDD4抑制剂中添加有透明质酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：顾川江，廉云飞，戈延茹，房秋雨，戚雪勇，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32