一种跨膜蛋白的检测方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种跨膜蛋白的检测方法。该方法为针对跨膜蛋白提取和制样的组合检测方法，包括：1）用膜蛋白抽提试剂提取组织或细胞中的跨膜蛋白获取膜蛋白提取物；2）在4‑37℃条件下对提取的膜蛋白提取物制样并对样品进行western blot检测。本发明专利技术提出的跨膜蛋白检测方法，采用的蛋白提取液配方简单，性能温和，对蛋白质的结构和活性影响小，却可以高效地提取膜蛋白；且在4‑37℃条件下制样，蛋白不易形成聚集体，可以有效保留蛋白的三级结构，对跨膜蛋白的结构功能及后续免疫学实验影响较小。

【技术实现步骤摘要】
一种跨膜蛋白的检测方法
本专利技术涉及生物
，更具体地，涉及一种跨膜蛋白的检测方法。
技术介绍
细胞膜蛋白（包括酶）以外在膜蛋白和内在膜蛋白两种形式分别与膜脂质相结合。外在膜蛋白是水溶性蛋白，以非共价键形式结合在膜表面蛋白质分子上，或结合在磷脂分子的亲水头上，而细胞膜磷脂分子的流动性与环境中的离子强度、温度等有关系，因此只要改变溶液的离子强度甚至提高温度就可以将外在膜蛋白从膜脂质上分离下来，而膜结构并不被破坏；内在膜蛋白又称跨膜蛋白，其将疏水的羟基部分与磷脂的疏水部分共价紧密结合，两端带有极性，贯穿膜的内外，这种结合方式有利于实现细胞与环境物质、能量和信息的交换，却使得膜蛋白提取变得很困难。钠钾ATP酶通道蛋白和ATP结合盒式蛋白属于细胞膜上两类比较重要且有代表性的蛋白质。钠钾ATP酶通道蛋白属于内在膜蛋白，可产生和维持膜电位，调节控制细胞内外的离子成分，建立势能储备，在细胞膜物质跨膜运输、信号传递和细胞识别等重要的生理功能中起着非常重要的作用；ATP结合盒式蛋白有两个跨膜结构域，具有保守的功能结构域，可参与信号转导、细胞解毒及病毒防御等重要的生理过程。钠钾ATP酶通道蛋白和ATP结合盒式蛋白与多种人类疾病相关，提高钠钾ATP酶通道蛋白及ATP结合盒式蛋白提取的数量和质量对于研究其功能有着重要的意义。实验室中常用SDS或者RIPA裂解液裂解细胞，从得到的裂解液中检测目的蛋白，这种检测方法存在以下不足：SDS裂解液和RIPA裂解液通常会破坏蛋白组件完整性，并且改变它们的结构和功能特性，不利于后续免疫学实验的进行；如果目的蛋白是膜蛋白，SDS或者RIPA裂解液的提取效率低，利用该方法检测目的膜蛋白是比较困难的，需要进一步富集，才能得到理想的实验结果。进一步来说，现在技术中膜蛋白的制样和检测过程中普遍存在以下问题：由于跨膜蛋白中嵌入脂双层内的蛋白是由一些非极性的氨基酸组成，疏水性很强，制样时若温度过高，则很容易形成聚集体，影响目的蛋白的检测。
技术实现思路
针对现有技术中的不足，本专利技术提出了一种跨膜蛋白的检测方法，该方法结合特定的提取条件和制样条件，膜蛋白提取率高且在4-37℃条件下制样，蛋白不易形成聚集体，可以有效保留蛋白的三级结构，有利于westernblot对于目的跨膜蛋白的检测。为实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种跨膜蛋白的检测方法，所述方法为针对跨膜蛋白提取和制样的组合检测方法，包括：1）用膜蛋白抽提试剂提取组织或细胞中的跨膜蛋白获取膜蛋白提取物；2）在4-37℃条件下对提取的膜蛋白提取物制样并对样品进行westernblot检测；所述组织或细胞中的跨膜蛋白的提取方法为：步骤1、取抽提试剂A加入干净组织或细胞中，破碎细胞，获取混合组分；步骤2、差速离心混合组分获取含有膜蛋白的粗组分；步骤3、以抽提试剂B选择性分离含有膜蛋白的粗组分，获取组织中的跨膜蛋白；所述抽提试剂A由以下成分组成：0.32MSucrose，10mMTris，1mMMgCl2•6H2O，120mMKCl，5mMEDTA，10mMNaF，调pH值至弱碱性；所述抽提试剂B由以下成分组成：50mMHEPES，150mMNaCl，100mMKCl，1mMMgCl2•6H2O，10wt%甘油，2wt%TritonX-100，5mMEDTA，2mMEGTA，调pH值至弱碱性。进一步地，所述跨膜蛋白为钠钾ATP酶通道蛋白、ATP结合盒式蛋白中的一种或两种。进一步地，所述差速离心的具体操作方法为：（1）4℃，300g离心混合组分10分钟，收集上清；沉淀使用膜蛋白抽提试剂A继续匀浆8-12次，4ºC，700g离心10分钟，收集并合并上清；（2）4℃，700g离心步骤（1）上清10分钟，收集上清液至一新的离心管中；（3）4℃，14000g离心步骤（2）所获上清液30分钟，以沉淀细胞膜碎片；继续4℃，14000g离心10秒，去除上清并保留沉淀。进一步地，所述选择性分离含有膜蛋白的粗组分的具体操作方法为：加入抽提试剂B，涡旋2分钟，然后冰浴10分钟；涡旋过程中，涡旋操作依照启动5-12秒、停止5-12秒重复循环直至2分钟结束，从而使膜蛋白更好地从磷脂双分子层脱离下来。进一步地，所述抽提试剂A的pH值调节至7.4。进一步地，所述抽提试剂B的pH值调节至7.4。进一步地，使用抽提试剂A之前，向抽提试剂A中加入蛋白酶抑制剂PMSF和原钒酸钠，所述PMSF和原钒酸钠的终浓度均为1µM。进一步地，使用抽提试剂B之前，向抽提试剂B中加入蛋白酶抑制剂PMSF和原钒酸钠，所述PMSF和原钒酸钠的终浓度均为1µM。进一步地，所述制样方法包括：（1）检测膜蛋白提取物中蛋白浓度；（2）根据步骤（1）测定的蛋白浓度，加入蛋白上样缓冲液，充分混合，浓度调整至4µg/µl，样品备用；（3）将步骤（2）制备好的样品静置于4-37℃条件下；（4）将步骤（3）中的样品在4℃，10000g的条件下离心5分钟，留上清用于westernblot检测。与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：（1）本专利技术提出的一种跨膜蛋白的检测方法，该方法结合特定的提取条件和制样条件，显著提高跨膜蛋白提取总量，且在4-37℃条件下制样，蛋白不易形成聚集体，有利于westernblot对于目的蛋白的检测，可以有效保留蛋白的三级结构，对跨膜蛋白的结构功能及后续免疫学实验影响较小。（2）本专利技术的膜蛋白抽提试剂主要成分是TritonX-100和蔗糖，裂解强度温和，对蛋白的活性和功能影响低；采用差速离心法进一步富集目的膜蛋白。因此，本专利技术优化的膜蛋白提取试剂配方简单、优化的提取工艺步骤简单，其膜蛋白提取率却显著提高。（3）本专利技术的检测方法所用试剂都是实验室常规试剂；同时，对于提取的膜蛋白的样品的处理只需要使用实验室常规的仪器设备，因此，本专利技术的检测方法适用于大部分实验室。附图说明图1A至D为实施例1方法提取的膜蛋白经4℃、25℃、37℃处理后进行钠钾ATP酶通道蛋白及ATP结合盒式蛋白的WB检测图，其中图1A、图1B、图1C、图1D分别为ATP1A1蛋白、ATP1A3蛋白、ABCC1蛋白、ABCC4蛋白的检测结果。图2A至D为实施例2中37℃处理RIPA裂解液、SDS裂解液、本专利技术的膜蛋白提取液后进行钠钾ATP酶通道蛋白及ATP结合盒式蛋白的WB对照检测图，其中图2A、图2B、图2C、图2D分别为ATP1A1蛋白、ATP1A3蛋白、ABCC1蛋白、ABCC4蛋白的检测结果。图3A至D为实施例3方法提取的膜蛋白在不同制样条件（不同温度）下钠钾ATP酶通道蛋白及ATP结合盒式蛋白的WB检测图，其中图3A、图3B、图3C、图3D分别为ATP1A1蛋白、ATP1A3蛋白、ABCC1蛋白、ABCC4蛋白的检测结果。具体实施方式展示一下实例来具体说本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种跨膜蛋白的检测方法，其特征在于，所述方法为针对跨膜蛋白提取和制样的组合检测方法，包括：1）用膜蛋白抽提试剂提取组织或细胞中的跨膜蛋白获取膜蛋白提取物；2）在4-37℃条件下对提取的膜蛋白提取物制样并对样品进行western blot检测；/n所述组织或细胞中的跨膜蛋白的提取方法为：/n步骤1、取抽提试剂A加入干净组织或细胞中，破碎细胞，获取混合组分；/n步骤2、差速离心混合组分获取含有膜蛋白的粗组分；/n步骤3、以抽提试剂B选择性分离含有膜蛋白的粗组分，获取组织中的跨膜蛋白；/n所述抽提试剂A由以下成分组成：0.32M Sucrose，10mM Tris，1mM MgCl

【技术特征摘要】
1.一种跨膜蛋白的检测方法，其特征在于，所述方法为针对跨膜蛋白提取和制样的组合检测方法，包括：1）用膜蛋白抽提试剂提取组织或细胞中的跨膜蛋白获取膜蛋白提取物；2）在4-37℃条件下对提取的膜蛋白提取物制样并对样品进行westernblot检测；
所述组织或细胞中的跨膜蛋白的提取方法为：
步骤1、取抽提试剂A加入干净组织或细胞中，破碎细胞，获取混合组分；
步骤2、差速离心混合组分获取含有膜蛋白的粗组分；
步骤3、以抽提试剂B选择性分离含有膜蛋白的粗组分，获取组织中的跨膜蛋白；
所述抽提试剂A由以下成分组成：0.32MSucrose，10mMTris，1mMMgCl2·6H2O，120mMKCl，5mMEDTA，10mMNaF，调pH值至弱碱性；
所述抽提试剂B由以下成分组成：50mMHEPES，150mMNaCl，100mMKCl，1mMMgCl2·6H2O，10wt%甘油，2wt%TritonX-100，5mMEDTA，2mMEGTA，调pH值至弱碱性。


2.根据权利要求1所述的一种跨膜蛋白的检测方法，其特征在于，所述跨膜蛋白为钠钾ATP酶通道蛋白、ATP结合盒式蛋白中的一种或两种。


3.根据权利要求1所述的一种跨膜蛋白的检测方法，其特征在于，所述差速离心的具体操作方法为：
（1）4℃，300g离心混合组分10分钟，收集上清；沉淀使用膜蛋白抽提试剂A继续匀浆8-12次，4ºC，700g离心10分钟，收集并合并上清；
（2）4℃，700g离心步骤（1）上清10分钟，收集上清液至一新的离心管中；
（3）4℃，14...

【专利技术属性】
技术研发人员：练杨华，晏剑虹，张瑶，
申请(专利权)人：武汉三鹰生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42