肝细胞癌中大血管侵犯的预测方法、试剂盒及其应用技术

本发明专利技术发现具有不同程度血管侵犯的HCC患者特异性的蛋白质标志物，进而提供一种用于预测肝细胞癌(HCC)患者大血管侵犯的方法。本发明专利技术还开发了肝细胞癌(HCC)患者大血管侵犯的检测试剂盒，可用于免疫印迹和免疫组织化学分析，通过试剂盒检测可以在HCC发生早期进行血管侵犯情况的诊断和分级，并为其治疗建议优化的治疗方案，从而降低HCC大血管侵犯的发生和提高HCC的预后和生存率。

【技术实现步骤摘要】
肝细胞癌中大血管侵犯的预测方法、试剂盒及其应用
本专利技术涉及一种肝细胞癌中大血管侵犯的预测方法。
技术介绍
肝细胞癌(HCC)是全球癌症相关死亡的第三大常见原因，每年导致约600,000例死亡。治疗性肝切除术现在被广泛认为是具有良好肝功能储备的HCC的首选治疗方法，特别是早期HCC。不幸的是，大约70％的HCC患者在根治性肝切除术后的5年内复发。而血管侵犯通常被认为是肝切除术后HCC患者预后的重要危险因素。肝细胞癌的血管侵犯可进一步分为微血管和大血管侵犯。微血管侵犯(MVI)定义为肿瘤迁移到内皮包围的血管空间内、仅在显微镜下可识别，而大血管侵犯(MAV)是指大量肿瘤侵入门静脉或肝静脉的主干或分支。MVI和MAV可能代表了血管侵犯的逐步过程，最终导致肝内传播和HCC的远端转移。多项研究显示，包括MVI和MAV在内的血管侵犯与HCC患者的生存呈负相关。MVI患者可以从解剖肝切除术，经导管治疗和放疗中获益。尽管最近的诊断和治疗方案有所改善，但大血管侵犯HCC的预后仍然令人沮丧。据报道，在支持治疗的情况下，患有MAV的HCC患者的中位生存期仅为2-6个月。MAV传统上被认为是手术切除的禁忌症，尽管有一些不一致的研究报道HCC与MAV的存活率通过根治性手术程序得到改善。包括巴塞罗那临床肝癌系统，欧洲肝病研究协会和亚太肝脏研究协会在内的国际指南建议将索拉非尼作为晚期HCC与MAV的唯一选择。然而，索拉非尼只能轻微改善生存期1-3个月。在诊断时，大约10-40％的HCC患者存在肝和/或门静脉的MAV。当早期诊断出HCC时报告的MAV发生率较低，而终末期HCC患者中发现MAV的发生率高达44％。研究表明，MAV与HCC的恶性程度和死亡率呈正相关。因此，在早期阶段找到更有希望的分子标志物用以诊断HCC的血管侵犯情况是迫切和必要的。同时，目前关于MAV发生的分子机制研究相当有限，阐明MAV在HCC中的潜在发生机制具有重要意义，这可能会引导治疗方法的创新，从而改善这种致命疾病的预后。氮(Nitrogen)是人体所有蛋白质、RNA和DNA的基本组成部分。尿素循环是肝脏中氮代谢的必需途径，由5种代谢酶类CPS1、OTC、ASS1、ARG1和ASL组成，用于氨的解毒，将高毒性氨转化为尿素排泄到体外。有多项研究表明在很多癌变肿瘤中，尿素循环中的关键酶类会处于下调或失活状态，从而增加废物氨的重新利用，再次转化为氨基酸，甚至被用来合成嘧啶进而支持癌细胞RNA和DNA的合成，最终帮助肿瘤的生长和增殖。然而，尽管尿素循环被报道与包括HCC在内的多种癌症的发生相关，其在具有大血管侵犯的HCC中的确切功能仍不清楚。近年来，基于多组学技术的精准医学获得了长足发展。基因组学的基因测序和转录组学、蛋白质组学以及代谢组学技术广泛应用于临床诊断和疾病发病机理的阐明。其中，蛋白质组学由于其研究对象蛋白质，不仅是生命活动的主要执行者，也是各种治疗方式的主要靶点，引起了极大的关注。通过蛋白质组学手段结合深入的生物信息学分析，从大队列临床病人样本中发现和确认疾病相关的标志物蛋白、信号通路和代谢途径，已经成为目前基础医学和临床研究的热点和重要手段。
技术实现思路
肝细胞癌(HCC)是世界上最致命的癌症之一。血管侵犯反映了HCC的侵袭性，被认为是肿瘤复发的关键危险因素。在本专利技术中，为了更好地了解HCC病人大血管侵犯和转移的分子机制并发现血管侵犯特异性的蛋白质标志物，我们进行了基于iTRAQ技术的高通量蛋白质组学研究，以确定MVI(-)，MVI(+)和MAV的HCC患者癌组织中显著失调的蛋白质。在具有MAV的HCC患者中，我们发现了47种蛋白质在其肿瘤组织中显著下调；而其中的30种蛋白在MVI(-)和MVI(+)的HCC患者肿瘤组织中是没有变化的。这些蛋白尤其是尿素循环中的关键酶类作为大血管侵犯HCC患者中特异的临床相关的蛋白质组学特征，可以用于MAV的精准诊断，并且为MAV的治疗提供潜在的治疗靶标。为实现上述目的，本专利技术提供一种用于预测肝细胞癌(HCC)患者大血管侵犯的方法，当一或多种特异性的蛋白质标志物失调时，预测肝细胞癌(HCC)患者发生大血管侵犯，所述特异性的蛋白质标志物是基于高通量蛋白质组学研究在具有MAV的HCC患者中发现失调的蛋白质，所述失调是指表达水平上调或下调。在一个实施例中，所述上调是指变化倍数大于1.2倍，所述下调是指变化倍数小于0.8倍。在一个实施例中，所述特异性的蛋白质标志物失调是指Uniprot数据库中编号为P25325、P05062、P00167、P52758、Q93099、P04424、P11586、Q13228、P08319、P30084、P34913、Q6UX53、Q9UI17、P16930、P00966、P05089、P22033、A6NLP5、P55084、P42765、P31327、O75891、P05091、P09467、Q16822、Q53FZ2、Q9UBR1、Q93088、P00505、P54868、P36871、P35573、P80404、Q3LXA3、P06737、Q9Y2P5、Q16851、P33121、P50225、P08133、P23141、O95954、P45954、Q7Z4W1、P07108、Q9UBQ7、Q06278的47种蛋白中的一或多种的表达水平出现下调。在一个实施例中，所述特异性蛋白质标志物的表达水平失调是指CPS1、ASS1、ASL、ARG1、BHMT、DMGDH、AnnexinA6和CES1中的一或多种的表达水平出现下调。在一个实施例中，所述特异性蛋白质标志物失调是指CKAP4的表达水平出现上调。在一个实施例中，所述特异性蛋白质标志物失调是指尿素循环的5个关键酶CPS1、OTC、ASS1、ARG1和ASL中的一或多种的表达水平出现下调。在一个实施例中，所述特异性蛋白质标志物失调是指尿素循环的5个代谢酶类BHMT、BHMT2、DMGDH、SARDH和GLDC一或多种的表达水平出现下调。在一个实施例中，当所述患者出现与尿素循环的5个关键酶CPS1、OTC、ASS1、ARG1或ASL的表达水平出现下调或尿素循环上游的5个代谢酶类BHMT、BHMT2、DMGDH、SARDH或GLDC的表达水平出现下调相关的尿素循环紊乱时，预测肝细胞癌(HCC)患者发生大血管侵犯。在一个实施例中，所述特异性蛋白质标志物通过如下步骤确定：(1)通过手术或活检穿刺获得发生血管侵犯的肝细胞癌病人癌组织和相应癌旁组织；(2)将不同病人组织采用Bioruptor非接触式超声破碎高效提取总蛋白；(3)将获得的蛋白进行还原烷基化，并上样于超滤管进行胰蛋白酶酶解(4)对从不同病人组织获取的酶解肽段按照优化后流程进行iTRAQ试剂的标记，混合并真空抽干后进行样品的HPLC预分级；(5)将HPLC分级获得的肽段提交到在线二维液相色谱质谱联用系统(2D-LC-MS/MS)进行全蛋白质组学定量分析；(6)通过强大的后期生物信息学分析，高通量高准确本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于预测肝细胞癌(HCC)患者大血管侵犯的方法，其特征在于，当一或多种特异性的蛋白质标志物失调时，预测肝细胞癌(HCC)患者发生大血管侵犯，所述特异性的蛋白质标志物是基于蛋白质组学研究在具有MAV的HCC患者中发现失调的蛋白质，所述失调是指表达水平上调或下调。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于预测肝细胞癌(HCC)患者大血管侵犯的方法，其特征在于，当一或多种特异性的蛋白质标志物失调时，预测肝细胞癌(HCC)患者发生大血管侵犯，所述特异性的蛋白质标志物是基于蛋白质组学研究在具有MAV的HCC患者中发现失调的蛋白质，所述失调是指表达水平上调或下调。


2.根据权利要求1所述的用于预测肝细胞癌(HCC)患者大血管侵犯的方法，其特征在于，所述特异性的蛋白质标志物失调是指Uniprot数据库中编号为P25325、P05062、P00167、P52758、Q93099、P04424、P11586、Q13228、P08319、P30084、P34913、Q6UX53、Q9UI17、P16930、P00966、P05089、P22033、A6NLP5、P55084、P42765、P31327、O75891、P05091、P09467、Q16822、Q53FZ2、Q9UBR1、Q93088、P00505、P54868、P36871、P35573、P80404、Q3LXA3、P06737、Q9Y2P5、Q16851、P33121、P50225、P08133、P23141、O95954、P45954、Q7Z4W1、P07108、Q9UBQ7、Q06278的47种蛋白中的一或多种的表达水平出现下调。


3.根据权利要求1所述的用于预测肝细胞癌(HCC)患者大血管侵犯的方法，其特征在于，所述特异性蛋白质标志物的表达水平失调是指CPS1、ASS1、ASL、ARG1、BHMT、DMGDH、AnnexinA6和CES1中的一或多种的表达水平出现下调。


4.根据权利要求1所述的用于预测肝细胞癌(HCC)患者大血管侵犯的方法，其特征在于，所述特异性蛋白质标志物失调是指CKAP4的表达水平出现上调。


5.根据权利要求1所述的用于预测肝细胞癌(HCC)患者大血管侵犯的方法，其特征在于，所述特异性蛋白质标志物失调是指尿素循环的5个关键酶CPS1、OTC、ASS1、ARG1和ASL中的一或多种的表达水平出现下调。


6.根据权利要求1所述的用于预测肝细胞癌(HCC)患者大血管侵犯的方法，其特征在于，所述特异性蛋白质标志物失调是指尿素循环上游的5个代谢酶类BHMT、BHMT2、DMGDH、SARDH和GLDC一或多种的表达水平出现下调。


7.根据权利要求1所述的用于预测肝细胞癌(HCC)患者大血管侵犯的方法，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：方雷，杜荣辉，王忠夏，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32