一种适合质谱检测的样本前处理组合物、样本前处理方法及应用技术

本发明专利技术涉及适合质谱检测的样本前处理组合物、样本前处理方法及应用，通过本发明专利技术提供的样本前处理方法可以准确分离样本中的目标糖基化蛋白，富集的糖基化蛋白无需其他处理，可以直接上质谱检测，为质谱检测分析提供简便的前处理方法，使质谱分析仪可以对肿瘤、自身免疫疾病等相关疾病进行筛查及检测，本发明专利技术对质谱检测具有重要意义，具有极高的灵敏度，方法快速简便而且易于自动化。

【技术实现步骤摘要】
一种适合质谱检测的样本前处理组合物、样本前处理方法及应用
本专利技术属于医疗器械及体外诊断的
，涉及一种适合质谱检测的样本前处理组合物、样本前处理方法及应用。
技术介绍
质谱检测(massspectrometry，MS)的基本原理是：使分子或原子等粒子在离子源中发生电离，并在加速电场的作用下，让所发生电离对的分子或原子进入质量分析器，利用电场、磁场使各种离子按质荷比发生色散和聚焦，从而确定其质量，并根据质量及图谱分析确定待测样品的类型和数量。从20世纪40年代开始，质谱广泛用于有机物质分析，并相继出现了气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术、场解析(FD)技术、等离子体解析(PD)技术、快速原子轰击(FAB)、热喷雾(TS)等离子化技术，实现了对复杂混合物、极性较大的生物分子的分析和鉴定，可分析和鉴定的相对分子质量范围达到了千道尔顿(KDa)级别及以上。电喷雾电离(ESI)和基质辅助激光解析电离(MALDI)两大软电离技术的实现，使蛋白质、核酸和聚糖这样高极性、难挥发、热不稳定、质量可高达几十万的生物大分子高效、持续、稳定地生成准分子离子；电喷雾电离(ESI)和基质辅助激光解析电离(MALDI)与离子阱质谱分析仪(IT)、三重串联四极杆质谱分析仪(QQQ)、飞行时间质谱分析仪(TOF)和傅里叶变换离子回旋共振质谱分析仪(FTICR)等高性能质谱分析器联合使用后，可以实现生物大分子的质谱分析、定量分析和相对分子质量测定，并且检出限可达到皮摩尔级(ppm)甚至更低。糖基化是蛋白质形成过程中一种最常见的蛋白翻译后修饰，人体样本中50％以上的蛋白都具有糖基化修饰，其对蛋白的结构和功能有着重要影响。其中两种主要类型的糖基化为：N-糖基化和粘蛋白型O-糖基化。其中：1、N-糖基化蛋白的N-糖基化发生在蛋白特征序列Asn-Xaa-Ser/Thr，即N-X-S/T，糖链的还原末端通过Asn的侧链氨基与蛋白质相连。N-糖链由五糖核心和分支(或天线)两部分构成，其中，五糖核心由两个乙酰葡糖胺(GlcNAc)和三个甘露糖(Man)组成，某些情况下，还原末端的乙酰葡糖胺(GlcNAc)还会与一个岩藻糖(Fuc)连接，形成核心岩藻糖结构。五糖核心通常连接2-4条分支，根据分支类型的不同，N糖基化蛋白细分为三种亚型，即：高甘露糖型、复杂型和杂合型。其中：(1)高甘露糖型N糖基化蛋白的糖链分支均由甘露糖组成；(2)复杂型N糖基化蛋白的糖链分支由乙酰葡糖胺、半乳糖(Gal)、唾液酸(Sia)等单糖按照特定的顺序依次连接而成；(3)杂合型N糖基化蛋白的糖链分支同时含有上述两种分支。2、O-糖基化蛋白的O-糖基化发生在氨基酸残基Ser/Thr上，糖链还原末端与Ser/Thr的侧链羟基相连。与N-糖基化蛋白相比，O-糖基化蛋白的糖基化位点不具有保守性的蛋白特征序列，且存在多种核心结构。O-糖基化蛋白的糖链的单糖组成较为简单，但连接方式和亚型多，因此结构更为复杂，常见O-糖基化蛋白有以乙酰半乳糖胺(GalNAc)为还原末端的O-糖基化蛋白。大量研究发现，异常的糖基化现象往往与疾病密切相关，包括癌症和先天性糖链缺陷等。糖基化修饰过程中形成的糖链结构异常蛋白已经被确定为病毒性疾病、糖尿病、自身免疫疾病、癌症、遗传性疾病等疾病的一种标志物，它在疾病的发生、进展和转移方面具有重要意义，也为疾病诊断和研究提供了一个新的诊断方法。目前，已发现的糖链结构异常蛋白包括：用于肝癌的AFP，用于卵巢癌的CA125，用于结肠癌的CEA和用于前列腺癌的PSA、与聚糖相关的标志物例如CA19-9、转铁蛋白、碱性磷酸酶、r-谷氨酰转移酶、人绒毛膜促性腺激素(HCG)、T抗原、a1抗胰蛋白酶、前列腺酸性磷酸酶、结合珠蛋白、免疫球蛋白IgG、球蛋白A、血浆铜蓝蛋白等。质谱检测(MS)是一种常用的对糖基化蛋白进行研究的方法，但是，目前采用质谱检测对糖基化蛋白(包括糖链结构异常蛋白)进行研究的手段主要包括将蛋白质水解成肽段和/或将蛋白质、肽段上的糖链解离成独立的糖链结构后，对肽段或糖链进行检测分析。另外，常见质谱检测分析仪在使用过程中均不能直接检测含有无机盐离子的蛋白质溶液，或使用含无机盐离子的液体作为流动相，无机盐离子在质谱检测雾化过程中会大量残留在质谱仪内部，从而影响质谱检测的准确性和质谱仪的使用寿命；而蛋白质分离、纯化常用的蛋白质保护溶液均含有无机盐离子，如：磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液等无机盐离子缓冲液；因此，蛋白质溶液在进行质谱检测前，必须通过各种手段或方法进行脱盐处理，如化学纯化法、色谱纯化法、蛋白电泳分离纯化法等；而不能直接进行质谱检测。所以，目前对糖基化蛋白采用质谱检测进行研究时，样本前处理的主要步骤包括：糖基化蛋白分离纯化、脱盐处理、蛋白酶水解成小片段肽段，和/或将蛋白质上的糖链进行解离成独立的糖链结构，再进行相应的质谱检测分析等。上述各种糖基化蛋白质谱检测的前处理方法，必须经过酶切、糖链解离、脱盐等多步处理，才能对糖基化蛋白的糖链或糖肽进行质谱检测分析，操作复杂且价格昂贵，极大限制了作为质谱前处理方法的应用。而且经过上述前处理方法后，质谱不是直接检测糖基化蛋白这类的大分子蛋白，例如直接检测相对分子量大于10000道尔顿(10KDa)的糖链结构异常蛋白，而是对糖基化蛋白的糖链或糖肽进行质谱检测分析，但是糖链的检测对疾病的诊断应用具有较大的限制作用，不适合直接用于相关疾病的诊断。有报道显示，通过释放糖链并进行质谱检测可以鉴别多种不同类型的糖链；然而，疾病的发生往往与特定蛋白的异常糖基化有关，单独的糖链分析无法准确识别是否为特定蛋白的异常糖基化糖链，对疾病的诊断应用具有较大的限制作用。
技术实现思路
针对上述问题和为了克服上述现有技术的不足，本专利技术提供了一种适合质谱检测的样本前处理组合物、样本前处理方法及其应用；通过本专利技术提供的样本前处理组合物、样本前处理方法及应用，所得到的糖基化蛋白溶液无需经过再次的蛋白纯化、脱盐处理，酶切得到肽段、或糖链解离等步骤的单独处理或组合处理，即可直接进行质谱检测(MS)分析；对应用质谱检测(MS)检测人血液样本中大分子量的糖链结构异常蛋白提供重大且有效支持，并对质谱检测(MS)的快速发展，自动化检测和在临床疾病诊断中的进一步推广应用均有着重要的应用价值和社会效益。本专利技术提供一种适合质谱检测的样本前处理组合物，其包括偶联有凝集素的载体和洗脱液，所述偶联有凝集素的载体用于特异性分离待测样本中的目标糖基化蛋白，所述洗脱液用于洗脱偶联有凝集素的载体上吸附的目标糖基化蛋白；其中：所述洗脱液洗脱获得的目标糖基化蛋白溶液直接用于质谱检测分析。所述偶联有凝集素的载体当然包括用于偶联凝集素的载体和与所述用于偶联凝集素的载体发生偶联的凝集素。上述样本前处理组合物在某些实施方式中，所述目标糖基化蛋白包括N-糖基化蛋白、O-糖基化蛋白中的至少一种。上述样本前处理组合物在某些实施方式中，所述N-糖基化蛋白进一步包括高甘露糖型N糖基化蛋白、复杂型N糖基化蛋白和杂合型N糖基化蛋白中的至本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种适合质谱检测的样本前处理组合物，其包括偶联有凝集素的载体和洗脱液，所述偶联有凝集素的载体用于特异性分离待测样本中的目标糖基化蛋白，所述洗脱液用于洗脱偶联有凝集素的载体上吸附的目标糖基化蛋白；其中：所述洗脱液洗脱获得的目标糖基化蛋白溶液直接用于质谱检测分析。/n

【技术特征摘要】
1.一种适合质谱检测的样本前处理组合物，其包括偶联有凝集素的载体和洗脱液，所述偶联有凝集素的载体用于特异性分离待测样本中的目标糖基化蛋白，所述洗脱液用于洗脱偶联有凝集素的载体上吸附的目标糖基化蛋白；其中：所述洗脱液洗脱获得的目标糖基化蛋白溶液直接用于质谱检测分析。


2.根据权利要求1所述样本前处理组合物，其特征在于，所述目标糖基化蛋白包括N-糖基化蛋白、O-糖基化蛋白中的至少一种。


3.根据权利要求2所述样本前处理组合物，其特征在于，所述N-糖基化蛋白包括高甘露糖型N糖基化蛋白、复杂型N糖基化蛋白和杂合型N糖基化蛋白中的至少一种。


4.根据权利要求2所述样本前处理组合物，其特征在于，所述N糖基化蛋白包括核心岩藻糖基化的N糖基化蛋白。


5.根据权利要求4所述样本前处理组合物，其特征在于，所述核心岩藻糖基化的N糖基化蛋白包括α-1,6-核心岩藻糖基化的N糖基化蛋白。


6.根据权利要求2所述样本前处理组合物，其特征在于，所述O-糖基化蛋白包括以乙酰半乳糖胺为还原末端的O-糖基化蛋白。


7.根据权利要求1所述样本前处理组合物，其特征在于，所述目标糖基化蛋白为相对分子量大于等于10000道尔顿大分子量的糖基化蛋白。


8.根据权利要求7所述样本前处理组合物，其特征在于，所述目标糖基化蛋白包括：用于肝癌诊断的核心岩藻糖基化糖链结构异常蛋白AFP-L3、用于类风湿性关节炎早期诊断的IgG糖链结构异常蛋白IgG0、用于IgA肾病诊断的IgA糖链结构异常蛋白IgA1、用于妊娠反应和肿瘤标志物诊断的人绒毛膜促性腺激素HCG中的一种、两种或三种。


9.根据权利要求8所述样本前处理组合物，其特征在于，所述目标糖基化蛋白同时包括：用于肝癌诊断的核心岩藻糖基化糖链结构异常蛋白AFP-L3、用于类风湿性关节炎早期诊断的IgG糖链结构异常蛋白IgG0、用于IgA肾病诊断的IgA糖链结构异常蛋白IgA1和用于妊娠反应和肿瘤标志物诊断的人绒毛膜促性腺激素HCG。


10.根据权利要求1所述样本前处理组合物，其特征在于，每1ml用于偶联凝集素的载体上偶联有凝集素1-30mg。


11.根据权利要求1所述样本前处理组合物，其特征在于，用于偶联凝集素的载体包括磁珠，可选地为粒径分布范围为0.1μm-200μm的磁珠，进一步可选为粒径分布范围为1μm-200μm或20μm-200μm的磁珠。


12.根据权利要求11所述样本前处理组合物，其特征在于，所述磁珠包括表面经高分子材料处理形成的复合磁珠；所述高分子材料优选为环氧树脂、硅化物、聚苯乙烯、葡聚糖、琼脂糖、树脂、牛血清白蛋白、生物素、纤维素的任意一种。


13.根据权利要求12所述样本前处理组合物，其特征在于，所述高分子材料还包括环氧树脂、硅化物、聚苯乙烯、葡聚糖、琼脂糖、树脂、牛血清白蛋白、生物素、纤维素中两种及两种以上高分子材料的复合物。


14.根据权利要求1所述样本前处理组合物，其特征在于，所述偶联有凝集素的载体通过包括以下步骤的方法获得：将除去保存液后并清洗干净的磁珠与凝集素混合，震荡反应；可选地，每1ml磁珠要加入1-30mg凝集素；进一步可选地，所述磁珠为表面经琼脂糖处理形成的琼脂糖磁珠；更进一步可选地震荡反应的条件为在0.1-1M、pH6-7、含0.1-0.5MNaCl的MES缓冲液，室温条件下震荡反应0.5-5h。


15.根据权利要求1所述样本前处理组合物，其特征在于，所述凝集素包括：植物凝集素、动物凝集素。


16.根据权利要求15所述样本前处理组合物，其特征在于，所述植物凝集素为：木菠萝凝集素、花生凝集素、豌豆凝集素VVA和/或VVL、刀豆凝集素、小扁豆凝集素、麦胚素、大豆凝集素、芸豆凝集素的至少一种。


17.根据权利要求15所述样本前处理组合物，其特征在于，所述动物凝集素为蜗牛凝集素HAA和/或HPA。


18.根据权利要求1所述样本前处理组合物，其特征在于，所述凝集素包括两种及两种以上凝集素的复合物。


19.根据权利要求1所述样本前处理组合物，其特征在于，所述偶联有凝集素的载体包括偶联有小扁豆凝集素的载体、偶联有芸豆凝集素的载体、偶联有刀豆凝素A的载体或偶联有蜗牛凝集素的载体中的一种、两种或三种。


20.根据权利要求1所述样本前处理组合物，其特征在于，所述偶联有凝集素的载体同时包括偶联有小扁豆凝集素的载体、偶联有芸豆凝集素的载体、偶联有刀豆凝集素A的载体和偶联有蜗牛凝集素的载体；可选地，偶联有...

【专利技术属性】
技术研发人员：李艳召，王秀利，王杰，许彬，林长青，
申请(专利权)人：糖谱北京科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11