本发明专利技术提供了一种新的可应用于肝癌检测场景的甲基化检测和分析方法，不仅能在常规测序条件下获得优异的分类性能，而且在低覆盖度的测序条件下，也具有非常良好的表现，克服了现有技术中关于cfDNA进行DNA甲基化分析需要深度测序的偏见，极大地降低了测序成本，扩大了甲基化测序技术的适用范围，可为肝病早筛、肝病诊断、肝病监测、肝病患者分型、肝癌治疗或手术干预有效性评估等临床应用提供基础数据。
【技术实现步骤摘要】
HBV整合位点附近区域甲基化状态在癌症检测中的应用
本专利技术涉及分子生物学
，特别涉及一种利用HBV整合位点附近区域甲基化状态进行癌症相关检测的方法。
技术介绍
外周血游离DNA(cfDNA)是在人体血浆、尿液和其他体液中发现的小的双链DNA片段[1,2]，起源于细胞凋亡和坏死[3]。cfDNA分析被视为“液体活检”的一种方式，已经被用于基因检测[4,5]，早期癌症检测[6,7]，以及疾病预后预测[8,9]。凋亡和坏死的肿瘤细胞可以将cfDNA释放到外周血中，这反映了肿瘤相关的遗传特征，包括cfDNA片段大小(cfDNAsize)[10]，以及突变、拷贝数畸变和表观遗传变化等[8]。同时，cfDNA还携带组织特异性信息，这为其来源组织的推断提供了应用前景[11-15]。因此，cfDNA可以作为一种重要的生物标志物用于临床。肝癌是全球癌症相关死亡的第四大原因。在美国，2000-2016年间，肝癌死亡率从7.2/10万上升到10.3/10万[16,17]。肝细胞癌(HCC)是原发性肝癌最常见的形式，通常发生于因乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、酒精滥用或非酒精性脂肪肝引起的慢性肝病患者[18,19]。慢性炎症、纤维化和异常肝细胞再生造成一系列遗传和表观遗传事件，最终导致肝细胞恶性转化。肝癌的发生是一个复杂而鲜为人知的多步骤过程，包括从肝硬化背景下的再生结节到不典型增生结节，最终是HCC的组织学转变[20-22]。肝硬化患者发生HCC的高风险(即每年风险2-7％)证明了建议在高危患者中使用腹部超声(US)结合或不联合血清甲胎蛋白(AFP)进行两年一次的HCC筛查[23]。非随机化研究表明，早期发现HCC增加了接受治愈性治疗的几率，并增加了生存率。然而，US和AFP对早期HCC检测的敏感性为63％，这突出了对改进早期筛查方案的需求。许多研究开始尝试将cfDNA作为发现肝癌早期检测的潜在生物标志物的对象。类似的尝试包括开展了突变分析[24,25]，循环肿瘤细胞(CTCs)[26]以及DNA甲基化[27-32]。与突变和CTC不同，cfDNA的DNA甲基化分析具有提供组织起源信息的理论优势，当cfDNA来源于混合的细胞类型时，这是至关重要的。多项研究集中在特定甲基化改变作为生物标志物[28,32]，肿瘤基因组范围内整体低甲基化[27]以及基于甲基化水平推断起源组织[29-31]。目前很多研究集中于将cfDNA的甲基化作为肿瘤诊断的标志物，有不同的技术来研究cfDNA的甲基化变化，包括scRRBS[11]和cfMeDIPseq[14]，这两种方法通过不同的手段尝试富集CpG岛的片段，仅占基因组区域的1％，从而降低测序量，该方案并未降低每个位点的测序覆盖度需求，不属于低覆盖度检测，而且基因组的覆盖区域有限，降低的是分析检测的基因组区域大小，需要依靠实验手段进行DNA片段的筛选，也引入了实验偏差的风险。全基因组甲基化测序(WGBS)由于其单胞嘧啶度量和高准确性而成为DNA甲基化分析的金标准[33]，使用WGBS对肿瘤进行检测的挑战之一是在总的cfDNA背景下肿瘤DNA量极少，特别是在早期肿瘤和微小残留病灶的患者中，这就需要通过深度测序产生对早期肿瘤检测和监督更敏感的标志物，往往需要30-100重的全基因组覆盖度[29,31]，测序成本极高，限制了其在目前临床环境中的大规模应用。基于cfDNA中特定基因位点的甲基化水平来筛查肿瘤，这种方案依据的不是全基因组范围内的甲基化水平检测，仅依靠部分位点的选择，但肿瘤的异质性(不同人肿瘤基因组中变化的差异)非常大，因而这些检测即便在研究所用的样本中表现出极好的特异性和灵敏度，但更换样本后，会由于选择候选位点在新的临床样本中并不一定表现出期望监测到的变化而无法达到研究样本中的表现，因而需要提供不依赖于特定甲基化标志位点的，在全基因组水平上通过生物信息学手段建立低甲基化评估的方法。发现新的癌症标志物、探索降低DNA甲基化测序成本、降低cfDNA样品在甲基化测序中限制的方法，低覆盖度测序和相应的低测序成本将成为促进基于DNA甲基化监测工具临床部署的关键。
技术实现思路
为了解决现有技术存在的缺陷，本专利技术的一个目的在于提供一种新的可应用于癌症检测场景的甲基化分析方法，该方法的形成基于专利技术人的一个令人吃惊的发现，即以乙肝病毒整合位点附近区域的甲基化状态作为指标所构建的分类模型，不仅能在常规测序条件下获得优异的分类性能，而且在低覆盖度的测序条件下，也具有非常良好的表现，克服了现有技术中关于cfDNA进行DNA甲基化分析需要深度测序的偏见。为了实现上述目的，本专利技术提供了一种DNA甲基化状态的检测方法，所述甲基化状态是乙肝病毒整合位点附近区域的甲基化状态，所述乙肝病毒整合位点附近区域是包含乙肝病毒在宿主基因组上的整合位点以及整合位点两侧宿主基因组序列的区域。在一些实施例中，所述甲基化状态通过测序或者聚合酶链式反应(PCR)获得；优选地，所述甲基化状态通过亚硫酸氢盐测序法、基因组直接测序法、甲基化特异性的PCR或者高分辨率熔解曲线法获得；更优选地，所述甲基化状态通过基于重亚硫酸盐转化的甲基化测序方法获得；特别优选全基因组重亚硫酸氢盐测序(WGBS)或者靶向重亚硫酸盐测序获得。在一些实施例中，所述测序为高覆盖度测序、中等覆盖度测序或者低覆盖度测序；优选地，所述测序的覆盖度满足以下条件中的一种或几种：i)所述测序的覆盖度以读段对(readpair)的数量计小于1×107个读段对，或者优选3×106-7×106个读段对，或者特别优选5×106个读段对；和/或ii)所述测序的覆盖度以读段(read)的数量计小于2×107个读段，或者优选6×106-1.4×107个读段，或者特别优选1×107个读段。在一些实施例中，所述甲基化状态是在全基因组范围内或者在基因组中部分区域内的一个或多个乙肝病毒整合位点附近区域的甲基化状态；优选地，所述甲基化状态是已报道的乙肝病毒整合位点中的全部或部分位点附近区域的甲基化状态。在一些实施例中，所述基因组中部分区域是感兴趣的目标区域；优选地，所述基因组中部分区域的长度为1M以上、10kb以上1M以下、10kb或者10kb以下。在一些实施例中，所述基因组中部分区域是13号染色体19442162-20713822位、1号染色体10121993-12279387位、10号染色体11149668-13266296位、10号染色体38027603-39151628位和/或10号染色体84035111-85772043位。在一些实施例中，所述基因组中部分区域是1号染色体115071623-115081623位、1号染色体37021302-37031302位、10号染色体5584724-5594724位、10号染色体81656529-81666529位和/或11号染色体120177705-120187705位。在一些实施例中，所述乙肝病毒整合位点附近区域是宿主基因组中乙肝病毒整合位点上游本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种DNA甲基化状态的检测方法，其特征在于，所述甲基化状态是乙肝病毒整合位点附近区域的甲基化状态，所述乙肝病毒整合位点附近区域是包含乙肝病毒在宿主基因组上的整合位点以及整合位点两侧宿主基因组序列的区域。/n
【技术特征摘要】
1.一种DNA甲基化状态的检测方法，其特征在于，所述甲基化状态是乙肝病毒整合位点附近区域的甲基化状态，所述乙肝病毒整合位点附近区域是包含乙肝病毒在宿主基因组上的整合位点以及整合位点两侧宿主基因组序列的区域。
2.一种肝癌标志物或标志物组合的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法以乙肝病毒整合位点附近区域的甲基化状态作为指标筛选与肝癌相关的标志物，所述乙肝病毒整合位点附近区域是包含乙肝病毒在宿主基因组上的整合位点以及整合位点两侧宿主基因组序列的区域。
3.根据权利要求2所述的筛选方法获得的肝癌标志物或肝癌标志物组合。
4.用于肝癌检测、肝癌风险预测、肝癌筛查、肝癌诊断、肝癌监测、肝癌用药指导和/或肝癌预后判断的模型的构建方法，其特征在于，使用根据权利要求2所述的筛选方法筛选得到的肝癌标志物或肝癌标志物组合构建肿瘤筛查模型，或者使用根据权利要求3所述的肝癌标志物或肝癌标志物组合构建肿瘤筛查模型。
5.肝癌检测、肝癌风险预测、肝癌筛查、肝癌诊断、肝癌监测、肝癌用药指导和/或肝癌预后判断的方法，其特征在于，所述方法包含以下步骤：
a)测定根据权利要求3所述的肝癌标志物或肝癌标志物组合的甲基化状态；
b)将a)中获得的甲基化状态作为输入数据，输入根据权利要求4所述的构建方法构建的模型中。
6.特异性检测权利要求3所述的肝癌标志物或肝癌标志物组合的试剂在制备肝癌检测、肝癌风险预测、肝癌筛查、肝癌诊断、肝癌监测、肝癌用药指导和/或肝癌预后判断的试剂盒中的用途。
【专利技术属性】
技术研发人员：曾长青，张海坤，
申请(专利权)人：中国科学院北京基因组研究所国家生物信息中心，
类型：发明
国别省市：北京;11
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