基于TCGA数据库的乳腺癌甲基化生物标志物及其筛选方法技术

本发明专利技术公开了基于TCGA数据库的乳腺癌甲基化生物标志物及其筛选方法，具体地，本发明专利技术提供了一种通过特定甲基化位点从而进行早期乳腺癌特异性诊断的方法。该方法具有高特异性，可以有效区分不同肿瘤以及乳腺癌的各种亚型。

【技术实现步骤摘要】
基于TCGA数据库的乳腺癌甲基化生物标志物及其筛选方法
本专利技术涉及医学计算机应用领域，具体地，本专利技术涉及一种基于TCGA数据库的乳腺癌甲基化生物标志物筛选的方法及系统。
技术介绍
乳腺癌是全球女性癌症死亡率的癌种，2012年全球肿瘤流行病统计数据显示，每年有约167万的新确诊乳腺癌患者，超过50万的死亡乳腺癌患者。近年来，乳腺癌已成为中国女性最常见的癌症，分别是全球病例的12.2％，全球乳腺癌死亡比例的9.6％。乳腺癌的预后和肿瘤的及早发现也密切相关。世界范围内乳腺癌患者的持续增长迫切需要早期检测生物标志物。表观遗传变化包括DNA甲基化，是人类肿瘤形成最常见的分子变化之一，在乳腺癌中也不例外。DNA甲基化是在不改变DNA序列的情况下改变基因表达模式的可逆过程。低甲基化和高甲基化状态都与乳腺癌有关。相比于癌旁组织，肿瘤和转移组织中通常检测到低甲基化状态，从而增加癌基因的表达，激活转录，进而改变基因组的稳定性。CpG岛位于肿瘤抑制基因的启动子区域，通常在正常细胞中未甲基化。然而在癌细胞中，这些启动子区域异常的高甲基化参与肿瘤抑制基因转录沉默。这些表观遗传变化发生在正常组织的早期癌变阶段，最终导致乳腺癌的发展。目前对于引发乳腺癌的原因尚不明确，因此对于乳腺癌的早期检测和预防对于乳腺癌的诊断和治疗有着重要的作用，也是提高治愈率的关键。传统上乳腺病灶的发现依靠临床体检、乳腺定期自检，目前主要借助影像学检查，其中包括乳腺钼靶照相、全乳超声检查和乳腺磁共振检查。然而，影像学的检查往往在患者显示出明显的肿瘤发病迹象才能做出诊断，且普遍存在局限性，敏感性不够理想等问题。而DNA甲基化是表观遗传学的一种常见形式，其改变往往发生在体细胞癌变之前，是肿瘤发生的早期事件，在人体的多种体液中能够检测到甲基化的DNA,例如胆汁、排泄物以及血液。目前已检测到多种恶性肿瘤患者ctDNA中有多种基因存在异常甲基化,且与肿瘤患者的临床病理特征存在不同程度的相关性,具有检测稳定性好,组织特异性高的优点,使得DNA甲基化成为一个能够指导诊断、分期、判断预后及监测复发的有前景的生物标记。然而，本领域中尚缺乏高灵敏度和高准确度的能够用于乳腺癌早期筛查，特别是针对中国人群的乳腺癌早期筛查的甲基化生物标志物。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种高灵敏度和高准确度的能够用于乳腺癌早期筛查，特别是针对中国人群的乳腺癌早期筛查的甲基化生物标志物。本专利技术的第一方面，提供了一种肿瘤筛查试剂盒，所述的试剂盒包括用于检测甲基化位点的引物或引物对，且所述的甲基化位点包括一个或多个选自下组的位点：位于DBC1基因上的甲基化位点cg03625109；位于DBC1基因上的甲基化位点cg24818566；位于C9orf125基因上的甲基化位点cg13683194；和位于PDGFRB基因上的甲基化位点cgd16429070。在另一优选例中，所述的试剂盒用于肿瘤早期筛查。在另一优选例中，所述的肿瘤是乳腺癌。在另一优选例中，所述的甲基化位点还包括选自下组的一个或多个位点：位于RARB基因上的甲基化位点cg07996594；位于ESR1基因上的甲基化位点cg21646032；位于RUNX3基因上的甲基化位点cg07671949；位于PCDHGB7基因上的甲基化位点cg21185686；位于TIMP3基因上的甲基化位点cg23601468；和位于APC基因上的甲基化位点cg01240931。本专利技术的第二方面，提供了一种乳腺癌甲基化生物标志物筛选方法，所述方法包括以下步骤：1)从TCGA数据库获取实体瘤患者的的全基因组甲基化测序数据；2)根据获取的甲基化数据采用ANOVA进行位点注释及差异化分析；3)根据乳腺癌甲基化差异表达分析的结果进行ANOVA方差分析，筛选出乳腺癌差异性表达的甲基化位点；4)通过T检验，比较乳腺癌甲基化差异表达位点和其他31种实体瘤的甲基化位点，从而得到有效区分乳腺癌和其他实体瘤癌种的甲基化生物标记物。在另一优选例中，所述的方法还包括步骤：5)在临床实体瘤患者样本中，采用焦磷酸测序验证所述步骤4)中得到的甲基化位点的表达情况。在另一优选例中，所述的步骤1)包括：从TCGA数据库获取多种实体瘤的Illumina人类全基因组甲基化450k芯片数据及表型数据，其中芯片上各探针甲基化水平用β值表示，范围从0至1，分别代表未甲基化和完全甲基化。在另一优选例中，所述的步骤2)包括：采用R包TCGAbiolinks、dplyr、DT和SummarizedExperiment进行数据下载和分析。在另一优选例中，所述的步骤3)包括：3.1)选取p≤0.05的探针cgID进行候选乳腺癌甲基化基因的注释；3.2)选取对应基因上的探针cgID，并根据P值从小到大排列，选取前100个探针cgID作为候选的乳腺癌甲基化位点；较佳地，所述的步骤3)还包括：3.3)进一步用其他实体瘤癌种对应的100个探针cgID的甲基化数据进行T检验，根据T检验p值≤0.05且满足至多3个癌种无法显著区分的原则，筛选出乳腺癌特异性表达的甲基化位点。在另一优选例中，所述的步骤5)包括：5.1)临床选取多种实体瘤手术肿瘤样本；5.2)对肿瘤FFPE样本的基因组DNA进行提取，得到样本DNA；5.3)对所述的样本DNA进行甲基化处理，然后对甲基化位点进行PCR扩增；5.4)对所述的甲基化位点进行测序。在另一优选例中，所述的实体瘤手术肿瘤样本包括选自下组的样本：LuminalA分型乳腺癌样本、LuminalB分型乳腺癌样本、HER2分型乳腺癌样本、Basal-like分型乳腺癌样本、肺癌样本、胃癌样本，和结直肠癌样本。在另一优选例中，所述的步骤4)包括：采用焦磷酸测序法对所述步骤3)中筛选出的特异性表达甲基化位点进行测序，然后进行T检验，从而得到能够显著区分乳腺癌与其他癌种的甲基化位点。本专利技术的第三方面，提供了一种乳腺癌甲基化生物标志物筛选系统，其特征在于，所述的系统包括：i)获取模块，用于从TCGA数据库获取实体瘤患者的的全基因组甲基化测序数据；ii)位点注释及差异化分析模块，用于对获取的甲基化数据采用ANOCA进行位点注释及差异化分析；iii)乳腺癌差异表达甲基化位点筛选模块，用于根据乳腺癌基因甲基化位点的差异表达分析的结果进行ANOVA方差分析分析，筛选出乳腺癌差异化表达的甲基化位点。应理解，在本专利技术范围内中，本专利技术的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明图1.本专利技术实施例提供的基于TCGA数据库的乳腺癌甲基化生物标志物筛选的方法的流程图；图2.10个特异性表达甲基化本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种肿瘤筛查试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括用于检测甲基化位点的引物或引物对，且所述的甲基化位点包括一个或多个选自下组的位点：/n位于DBC1基因上的甲基化位点cg03625109；/n位于DBC1基因上的甲基化位点cg24818566；/n位于C9orf125基因上的甲基化位点cg13683194；和/n位于PDGFRB基因上的甲基化位点cgd16429070。/n

【技术特征摘要】
1.一种肿瘤筛查试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括用于检测甲基化位点的引物或引物对，且所述的甲基化位点包括一个或多个选自下组的位点：
位于DBC1基因上的甲基化位点cg03625109；
位于DBC1基因上的甲基化位点cg24818566；
位于C9orf125基因上的甲基化位点cg13683194；和
位于PDGFRB基因上的甲基化位点cgd16429070。


2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的甲基化位点还包括选自下组的一个或多个位点：
位于RARB基因上的甲基化位点cg07996594；
位于ESR1基因上的甲基化位点cg21646032；
位于RUNX3基因上的甲基化位点cg07671949；
位于PCDHGB7基因上的甲基化位点cg21185686；
位于TIMP3基因上的甲基化位点cg23601468；和
位于APC基因上的甲基化位点cg01240931。


3.一种乳腺癌甲基化生物标志物筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)从TCGA数据库获取实体瘤患者的的全基因组甲基化测序数据；
2)根据获取的甲基化数据采用ANOVA进行位点注释及差异化分析；
3)根据乳腺癌甲基化差异表达分析的结果进行ANOVA方差分析，筛选出乳腺癌差异性表达的甲基化位点；
4)通过T检验，比较乳腺癌甲基化差异表达位点和其他31种实体瘤的甲基化位点，从而得到有效区分乳腺癌和其他实体瘤癌种的甲基化生物标记物。


4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括步骤：
5)在临床实体瘤患者样本中，采用焦磷酸测序验证所述步骤4)中得到的甲基化位点的表达情况。


5.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的步骤1)包括：
从TCGA数据库获取多种实体瘤的Illumina人类全基因组甲基化450k芯片数据及表型数据，其中芯片上各探针甲基化水平用β值表示，范围从0至1，分别代表未甲基...

【专利技术属性】
技术研发人员：王雪春，顾学红，贾佳，
申请(专利权)人：嘉兴市第一医院，
类型：发明
国别省市：浙江;33