本发明专利技术公开了一种核苷酸序列组，包括正向引物和反向引物，用于扩增含有突变型KRAS基因的一部分；正向引物的3’末端对应突变型KRAS基因正义链中突变位点、突变位点向正义链5’端10个碱基以及突变位点向正义链3’端10个碱基中任何一个碱基的位置；或者反向引物的3’末端对应突变型KRAS基因反义链中突变位点、突变位点向反义链5’端10个碱基以及突变位点向反义链3’端10个碱基中任何一个碱基的位置。该核苷酸序列组还包括阻断核苷酸序列。采用本发明专利技术的核苷酸序列组，配合荧光定量PCR检测方法，可以将KRAS突变基因的检测灵敏度提升至0.01％。
【技术实现步骤摘要】
一种用于检测KRAS基因突变的核苷酸序列组及其应用
本专利技术涉及分子生物学领域，尤其涉及一种用于基因突变检测的核苷酸序列组及其应用。
技术介绍
ras基因家族中，与人类肿瘤相关的有HRAS、KRAS和NRAS，其中，KRAS对人类癌症影响最大。KRAS基因定位于12号染色体上，KRAS基因参与细胞内的信号传递。正常生理情况下，在细胞受到外界刺激后激活EGFR等信号通路时，野生型的KRAS被活性EGFR等酪氨酸激酶磷酸化后短暂活化，活化后的KRAS可以激活该信号通路中的下游信号蛋白，而后KRAS迅速失活。突变型KRAS蛋白导致蛋白功能异常，在无EGFR活化信号刺激下仍处于激活状态，导致肿瘤的持续增殖。KRAS的基因突变常见于肺癌、结直肠癌、腺癌等多种恶性肿瘤，在肺癌中的突变率为15～30％，在结直肠癌患者中的突变率为20～50％，与肿瘤细胞的生存、增殖、迁移、扩散、血管生成均有关系。检测KRAS基因突变是深入了解癌基因的情况、了解各种癌症的发展预后、放化疗疗效的重要指标。现有的KRAS基因突变检测方法中，组织活检侵袭性大，样本获取难度大，且异质性表现明显。测序法实验操作复杂，数据分析难度较大，成本较高，且检测周期长，很难满足临床需求。而基于循环肿瘤DNA(circulatingtumorDNA，ctDNA)的液体活检技术，可以非侵入的方式对肿瘤相关基因突变进行检测，而且患者普遍更容易接受非侵入性的样本采集方式。但是血清/血浆中ctDNA含量低，比如在肿瘤早期阶段，ctDNA仅占总游离DNA的0.01％，因此，常用的检测方法比如测序法和扩增阻碍突变系统法(amplificationrefractorymutationsystem，ARMS)的检测灵敏度无法完成有效检测。因此，本领域技术人员致力于开发一种提高KRAS基因突变检测灵敏度的方法。
技术实现思路
有鉴于现有技术中活检侵袭性大、测序法操作复杂、成本高及周期长以及常规荧光定量PCR检测方法灵敏度仅能达到1％的缺陷，本专利技术所要解决的技术问题是提供一种提高KRAS基因突变检测灵敏度的方法。为实现上述目的，本专利技术的一个方面提供了一种核苷酸序列组。在一个具体实施方式中，该核苷酸序列组包括正向引物和反向引物，用于扩增含有突变型KRAS基因的一部分；正向引物的3’末端对应突变型KRAS基因正义链中突变位点、突变位点向正义链5’端10个碱基以及突变位点向正义链3’端10个碱基中任何一个碱基的位置；或者反向引物的3’末端对应突变型KRAS基因反义链中突变位点、突变位点向反义链5’端10个碱基以及突变位点向反义链3’端10个碱基中任何一个碱基的位置。可选地，正向引物或反向引物上包括人为突变位点，人为突变位点使得正向引物与突变型KRAS基因的反义链不能完全互补；或者人为突变位点使得反向引物与突变型KRAS基因的正义链不能完全互补。可选地，人为突变位点位于距正向引物3’端1-10个碱基中任何一个的位置；或者人为突变位点位于距反向引物3’端1-10个碱基中任何一个的位置。在另一个具体实施方式中，核苷酸序列组还包括阻断核苷酸序列，阻断核苷酸序列对应于所述突变位点处的一段野生型KRAS基因，能减少或阻止所述正向引物或所述反向引物对野生型KRAS基因的扩增可选地，正向引物或反向引物上包括人为突变位点，人为突变位点使得正向引物与突变型KRAS基因的反义链不能完全互补；或者人为突变位点使得反向引物与突变型KRAS基因的正义链不能完全互补。可选地，人为突变位点位于距正向引物3’端1-10个碱基中任何一个的位置；或者人为突变位点位于距反向引物3’端1-10个碱基中任何一个的位置。可选地，该阻断核苷酸序列的3’端添加有2-5个相对于野生型KRAS基因的非互补碱基，或者添加有使阻断核苷酸序列本身不能延伸的3’端化学修饰。进一步可选地，3’端化学修饰为3'ddC、3'反向dT(3'InverteddT)、3'C3间隔子(3'C3spacer)、3'氨基(3'Amino)或3'磷酸化(3'phosphorylation)。在又一个具体实施方式中，正向引物和反向引物扩增的片段为包括突变位点的60-120bp长度的序列。可选地，正向引物和反向引物扩增的片段为包括所述突变位点的60-120bp长度的序列。可选地，正向引物和反向引物的序列长度为15-35bp，退火温度为55-65℃。在又一个具体实施方式中，突变位点选自野生型KRAS基因的第34位、第35位和第38位碱基中的一个或多个。在又一个具体实施方式中，核苷酸序列组还包括探针，探针带有荧光基团和淬灭基团。可选地，荧光基团选自FAM、HEX、CY5、VIC、TET、JOE和ROX；淬灭基团选自BHQ-1、BHQ-2、TAMRA和MGB。在一个具体实施方式中，该核苷酸序列组包括正向引物和反向引物，用于扩增含有突变位点的KRAS基因的一部分；正向引物的序列选自如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示的序列中的一个或多个。进一步地，反向引物的序列选自如SEQIDNO:4和SEQIDNO:11所示的序列中的一个或两个。。可选地，该核苷酸序列组还包括阻断核苷酸序列，阻断核苷酸序列的序列选自如SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示的序列中的一个或两个。可选地，该核苷酸序列组还包括探针，探针带有荧光基团和淬灭基团，该探针的核苷酸序列如SEQIDNO:12所示。本专利技术的第二个方面提供了一种试剂盒。在一个具体实施方式中，该试剂盒包括如上所述的核苷酸序列组。可选地，每一个正向引物的浓度均为300±200nM，每一个反向引物的浓度均为300±200nM，每一个阻断核苷酸序列的浓度均为0-4μM，探针的浓度为100-400nM。可选地，该试剂盒中还包括DNA聚合酶、镁离子、dNTP和缓冲液。本专利技术的第三个方面还提供了一种检测基因突变的方法，其特征在于，使用如上所述的核苷酸序列组进行PCR扩增。可选地，上述方法适用于检测循环肿瘤DNA、肿瘤组织DNA、细胞提取DNA和粪便提取DNA。可选地，采用荧光定量PCR进行检测。可选地，荧光信号通过荧光染料或荧光探针获得。采用本专利技术的核苷酸序列组，配合荧光定量PCR检测方法，可以将KRAS突变基因的检测灵敏度提升至0.01％，可以用于以血液中的ctDNA、肿瘤组织DNA、细胞提取DNA和粪便提取DNA为样本进行检测，从而有助于临床上对患者的基因突变状态进行判断。并且，当配合采用荧光定量PCR的检测方法时，实验操作简便，数据分析及结果判读直观，检测成本较低，能够在2小时内出具检测结果，能够最大限度满足临床需求。通过荧光染料对PCR产物进行标记跟踪，实时监控反应过程。通过软件对荧光积累信息进行分析和计算，能获得待测样品模板的初始浓度。以下将结合附图对本专利技术的构思、具体步骤及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本专利技术的目本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种核苷酸序列组，其特征在于，所述核苷酸序列组包括正向引物和反向引物，用于扩增含有突变型KRAS基因的一部分；所述正向引物的3’末端对应突变型KRAS基因正义链中突变位点、突变位点向正义链5’端10个碱基以及突变位点向正义链3’端10个碱基中任何一个碱基的位置；或者反向引物的3’末端对应突变型KRAS基因反义链中突变位点、突变位点向反义链5’端10个碱基以及突变位点向反义链3’端10个碱基中任何一个碱基的位置。/n
【技术特征摘要】
1.一种核苷酸序列组，其特征在于，所述核苷酸序列组包括正向引物和反向引物，用于扩增含有突变型KRAS基因的一部分；所述正向引物的3’末端对应突变型KRAS基因正义链中突变位点、突变位点向正义链5’端10个碱基以及突变位点向正义链3’端10个碱基中任何一个碱基的位置；或者反向引物的3’末端对应突变型KRAS基因反义链中突变位点、突变位点向反义链5’端10个碱基以及突变位点向反义链3’端10个碱基中任何一个碱基的位置。
2.如权利要求1所述的核苷酸序列组，其特征在于，所述核苷酸序列组还包括阻断核苷酸序列，所述阻断核苷酸序列对应于所述突变位点处的一段野生型KRAS基因，能减少或阻止所述正向引物或所述反向引物对野生型KRAS基因的扩增。
3.如权利要求2所述的核苷酸序列组，其特征在于，所述正向引物或所述反向引物上包括人为突变位点，所述人为突变位点使得所述正向引物与突变型KRAS基因的反义链不能完全互补；或者所述人为突变位点使得所述反向引物与突变型KRAS基因的正义链不能完全互补。
4.如权利要求3所述的核苷酸序列组，其特征在于，所述人为突变位点位于距正向引物3’端1-10个碱基中任何一个的位置；或者所述人为突变位点位于距反向引物3’端1-10个碱基中任何一个的位置。
【专利技术属性】
技术研发人员：李超群，王永成，王旭，谭英绮，
申请(专利权)人：成都华青精准医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：四川;51
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。