血液中环状RNA的检测方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种血液中环状RNA的检测方法及其应用。具体地，本发明专利技术提供了一种用于检测环状RNA分子的检测体系，所述体系包含：(a)一核酸探针；(b)一核酸外切酶；和(c)任选的待检测环状RNA分子；其中，当所述(a)中的核酸探针与所述(c)中的待检测环状RNA分子形成双链结构时，所述(b)中的核酸外切酶特异性地切割所述(a)中的Z4区域。本发明专利技术的检测体系和方法可以灵敏地检测出血液样品中是否含有目的环状RNA，并且可以准确地计算出血液中特定环状RNA的浓度。

【技术实现步骤摘要】
血液中环状RNA的检测方法及其应用
本专利技术属于生物
，具体地，本专利技术涉及一种血液中环状RNA的检测方法及其应用。
技术介绍
环状RNA是一种广泛存在于动植物体内的小分子非编码RNA，主要由线性RNA通过反向剪切拼接而成，其拼接后形成的特异性碱基序列是环状RNA区别与线性RNA的关键序列。近年来，随着高通量测序及核酸分子技术的不断革新，越来越多的研究资料显示环状RNA在机体的生长、发育、代谢、凋亡以及衰老等中发挥着重要的作用。在心血管领域，大量的基础研究提示环状RNA在多种心血管疾病如：高血压、急性心肌梗死、动脉粥样硬化及慢性心功能衰竭的发生、发展中发挥着重要的作用。并且，某些环状RNA在血液中的含量的改变可以作为心血管疾病诊断、危险分层及临床预后的生物标志物。相较于与他非编码RNA，环状RNA被作为心血管疾病诊断、危险分层及预后的分子标记物与其特殊的生物学特性有着密切的联系。所述的特殊的生物学特性包括：1)环状RNA分子缺乏3’端帽子及5’端多聚腺苷酸尾巴结构，可以耐受血液及环境中RNA酶的降解，因而具有较长的半衰期；2)环状RNA分子在不同的组织器官及细胞类型中，其种类及表达丰度具有显著的组织及细胞特异性。然而，目前国内外对于血液中环状RNA的检测方法涉及RNA的提取、纯化、逆转录等多个环节。传统的方法操作复杂，耗时冗长，因而大大限制了环状RNA在临床上的应用。因此，本领域迫切需要开发一种更加快速、准确、灵敏，并且操作简便的检测环状RNA分子的检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供一种更加快速、准确、灵敏，并且操作简便的检测环状RNA分子的检测方法。在本专利技术的第一方面，提供了一种用于检测环状RNA分子的检测体系，所述体系包含：(a)一核酸探针，所述的核酸探针为单链核酸探针，并且所述核酸探针从5’端至3’端具有如式I所示的结构，5’-Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-3’(式I)其中，Z1为无或长度为1-5bp的核苷酸序列；Z2为与待检测的环状RNA分子反向互补的核苷酸序列；Z3为第一基团携带区；Z4为核酸外切酶识别区；Z5为第二基团携带区；(b)一核酸外切酶，所述核酸外切酶可以特异性地识别所述Z4的核苷酸序列；和(c)任选的待检测环状RNA分子；其中，当所述(a)中的核酸探针与所述(c)中的待检测环状RNA分子形成双链结构时，所述(b)中的核酸外切酶特异性地切割所述(a)中的Z4区域。在另一优选例中，所述(a)中的核酸探针的长度为15-30bp，较佳地16-26bp，更佳地18-22bp。在另一优选例中，所述Z2的长度为15-35bp，较佳地18-30bp，更佳地20-24bp。在另一优选例中，所述Z2中，与待检测的环状RNA分子反向互补的区域优选为构成环状RNA闭环结构的两个不连续外显子(内含子)与外显子(内含子)之间互相连接的区域。在另一优选例中，所述Z2的核苷酸序列与互补包括完全反向互补，或基本上反向互补。在另一优选例中，所述的基本上反向互补是指：所述Z2的序列与所述完全反向互补的序列具有≥80％的序列同一性，较佳地≥90％，更佳地≥95％。在另一优选例中，所述核酸外切酶选自下组：5’-3’端核酸外切酶。在另一优选例中，所述核酸外切酶不切割完全单链形式的核酸分子。在另一优选例中，所述核酸外切酶特异性地切割具有部分双链结构的核酸分子。在另一优选例中，所述Z4为回文对称序列。在另一优选例中，所述Z3序列所携带的第一基团是荧光基团，并且所述Z5序列所携带的第二基团是淬灭基团。在另一优选例中，所述Z3序列所携带的第一基团是淬灭基团，并且所述Z5序列所携带的第二基团是荧光基团。在另一优选例中，所述荧光基团选自下组：FAM、HEX、CY5、CY3、VIC、JOE、TET、5-TAMRA、ROX、TexasRed-X，或其组合。在另一优选例中，所述淬灭基团选自下组：BHQ、TAMRA、DABCYL、DDQ，或其组合。在另一优选例中，所述Z3中，在所携带的第一基团的两侧可分别包含长度为15-30bp的核苷酸序列。在另一优选例中，所述Z5中，在所携带的第二基团的两侧可分别包含长度为15-30bp的核苷酸序列。在另一优选例中，所述的待检测环状RNA分子是疾病的诊断、危险分层和/或预后的分子标志物，所述的疾病选自下组：高血压、急性心肌梗死、动脉粥样硬化、慢性心功能衰竭、肿瘤、肾小球肾炎、肝炎、炎性肠病、系统性红斑狼疮、风湿系统疾病，或其组合。在本专利技术的第二方面，提供了一种用于检测环状RNA分子的试剂盒，所述试剂盒包括：(I)第一容器以及位于第一容器中的核酸探针，所述的核酸探针为单链核酸探针，并且所述核酸探针从5’端至3’端具有如式I所示的结构，5’-Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-3’(式I)其中，Z1为无或长度为1-5bp的核苷酸序列；Z2为与待检测的环状RNA分子反向互补的核苷酸序列；Z3为第一基团携带区；Z4为核酸外切酶识别区；Z5为第二基团携带区；(II)第二容器以及位于第二容器中的核酸外切酶，所述核酸外切酶可以特异性地识别所述Z4的核苷酸序列；和(III)任选的第三容器以及位于第三容器中的缓冲液。在另一优选例中，所述第一容器、第二容器和第三容器中的任何两个或三个(或全部)可以是相同或不同容器。在本专利技术的第三方面，提供了一种检测样品中是否存在待检测环状RNA分子的方法，包括步骤：(i)提供如本专利技术第一方面所述的检测体系，所述检测体系中包括疑似含有待检测环状RNA分子的样品；和(ii)检测所述体系中，所述第一基团或第二基团的信号强度。在另一优选例中，所述的方法包括定性检测和定量检测。在另一优选例中，所述的样品可来源于：血液、胸腔积液或腹腔积液。在另一优选例中，所述步骤(i)之前，还包括样品预处理步骤。在另一优选例中，所述样品预处理步骤中，包括将样品在室温下离心处理，优选地，所述离心处理为：在室温下，2500-3500rpm(较佳地3000rpm)，离心2-5分钟(较佳地3分钟)。在另一优选例中，所述样品预处理步骤中，还包括向所述样品中加入RNA酶和/或DNA酶并反应，所述反应的条件优选为37℃下20-40分钟(较佳地30分钟)，其中，所述RNA酶和DNA酶分别特异性地切割线性RNA和双链DNA。在另一优选例中，所述RNA酶时RNA-R酶。应理解，在本专利技术范围内中，本专利技术的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明图1显示了本专利技术检测体系的实验反应原理。图2显示了检测血本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测环状RNA分子的检测体系，其特征在于，所述体系包含：/n(a)一核酸探针，所述的核酸探针为单链核酸探针，并且所述核酸探针从5’端至3’端具有如式I所示的结构，/n5’-Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-3’ (式I)/n其中，/nZ1为无或长度为1-5bp的核苷酸序列；/nZ2为与待检测的环状RNA分子反向互补的核苷酸序列；/nZ3为第一基团携带区；/nZ4为核酸外切酶识别区；/nZ5为第二基团携带区；/n(b)一核酸外切酶，所述核酸外切酶可以特异性地识别所述Z4的核苷酸序列；和/n(c)任选的待检测环状RNA分子；/n其中，当所述(a)中的核酸探针与所述(c)中的待检测环状RNA分子形成双链结构时，所述(b)中的核酸外切酶特异性地切割所述(a)中的Z4区域。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于检测环状RNA分子的检测体系，其特征在于，所述体系包含：
(a)一核酸探针，所述的核酸探针为单链核酸探针，并且所述核酸探针从5’端至3’端具有如式I所示的结构，
5’-Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-3’(式I)
其中，
Z1为无或长度为1-5bp的核苷酸序列；
Z2为与待检测的环状RNA分子反向互补的核苷酸序列；
Z3为第一基团携带区；
Z4为核酸外切酶识别区；
Z5为第二基团携带区；
(b)一核酸外切酶，所述核酸外切酶可以特异性地识别所述Z4的核苷酸序列；和
(c)任选的待检测环状RNA分子；
其中，当所述(a)中的核酸探针与所述(c)中的待检测环状RNA分子形成双链结构时，所述(b)中的核酸外切酶特异性地切割所述(a)中的Z4区域。


2.如权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述(a)中的核酸探针的长度为15-30bp，较佳地16-26bp，更佳地18-22bp。


3.如权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述Z2中，与待检测的环状RNA分子反向互补的区域源自构成环状RNA闭环结构的两个不连续外显子(内含子)与外显子(内含子)之间互相连接的区域。


4.如权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述核酸外切酶不切割完全单链形式的核酸分子。


5.如权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述核...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡利栋，吴晓宇，李方方，李俊，刘少稳，
申请(专利权)人：上海市第一人民医院，
类型：发明
国别省市：上海;31