circRNA在系统性红斑狼疮病变免疫异常检测方法技术方案

本发明专利技术属于免疫和分子生物检测技术领域，公开了一种circRNA在系统性红斑狼疮病变免疫异常检测方法，收集外周血单个核细胞PBMCs标本，通过RNA‑seq测序技术，对基因表达进行检测分析；挑选出20个存在显著性差异的基因；基于circRNA参与转录后调控，对候选基因进行匹配分析，筛选出存在靶向结合的miRNA；通过对靶向结合的miRNA归纳总结，筛选出SLE当中具有代表性研究价值的miRNA。在细胞和分子水平进一步深入探讨淋巴细胞免疫平衡异常调控SLE发病中的作用方式和分子机制；解析circRNA调控表达的方式和作用靶点，明确其介导的信号通路并确认circRNA发挥功能效应的分子途径。

【技术实现步骤摘要】
circRNA在系统性红斑狼疮病变免疫异常检测方法
本专利技术属于免疫和分子生物检测
，尤其涉及一种circRNA在系统性红斑狼疮病变免疫异常检测方法。
技术介绍
目前，最接近的现有技术：长期以来，抗dsDNA抗体、补体活性和免疫复合物等免疫学检测一直是SLE疾病活动性的经典技术标志。但是主要障碍是1.相关的基因及表达产物同时与其他自身免疫病相关，特异性不高；2.SLE发病早期机体变化微小，病变产生的相关蛋白量很少，甚至无法出现；3个体之间存在较大差异。本技术从病因遗传因素出发结合RNA-seq高通量检测手段寻找发病特异性基因变量，并且探索了基因级联或相互作用启动疾病发生的方式。系统性红斑狼疮(systemiclupuserythematosus，SLE)是一种临床表现多样、病情变化快的典型的自身免疫性疾病，以自身抗体产生、免疫复合物沉积、多器官功能损害为主要特征。SLE缺乏有效治疗手段，常可导致患者死亡。因为目前缺乏有效的诊断标志物和治疗标志物。所以研究SLE生物标志物，无论对于早期诊断、病情活动监测、器官损害的可能性和损害程度的评估以及发现新的治疗靶点均至关重要。近年来，随着免疫学和分子生物学技术的不断发展，与SLE相关的新的发病机制和抗体相继被发现。系统性红斑狼疮的管理对于临床医师来说仍是挑战，关于该病的发病机制：系统性红斑狼疮(SLE)是一种典型的自身免疫性疾病，其发病原因不清，发病机制也尚未明确。一般认为是多因素的：受遗传因素和环境的影响，补体缺陷、B细胞和T细胞行为异常、细胞因子作用异常、细胞凋亡异常等。诊断标志物和治疗标志物等仍有待澄清。进一步导致的技术问题:很难从根本上找到调控疾病发生的靶点且操作难，可控性差等。circularRNA(circRNA)叫做环形RNA，是一种新的内源性非编码RNA，作为RNA家族的新成员成为研究热点。不具有5’帽子结构和3’尾巴结构，circRNA是闭合的环状结构，没有5’-3’极性和聚核苷酸的尾巴结构。在包括肿瘤在内的多种疾病的研究中，发现其与疾病的潜在关联，并在其中发挥重要的调控作用，有巨大的潜力成为新型的临床诊疗靶标。随着RNA测序技术和生物信息学的发展，显示在哺乳动物细胞中存在大量circRNA，其表达丰富、成内源性、结构保守且稳定。circRNA最主要的功能研究是参与转录后调控，类似于一个内源性RNA或miRNA的海绵，可以竞争性的抑制RNA/miRNA的转录调控。此外，circRNA还可以通过抑制转录起始位点调节可变剪切或转录。而且，circRNA还可以调节其亲本基因的表达。circRNA是RNA家族中有一个值得关注的热点，尽管目前人们对其了解还很浅，距离阐明其机制还相当遥远，但是其通过参与转录调控，丰富了人们的认知。其时空特异性和稳定性使其能够成为良好的生物标志物；而其与疾病的关联，可望成为潜在的临床诊疗标志物，具有巨大的应用前景。综上所述，现有技术存在的问题是：现有的系统性红斑狼疮的发病机制、诊断标志物和治疗标志物等不清楚。解决上述技术问题的难度：很难从根本上找到调控疾病发生的靶点且操作难，变量可控性差等。解决上述技术问题的意义：可以从基因水平，细胞水平等角度研究探索疾病诱因，进而找到可以特异、稳定、便捷、直观的检测标志物。降低不可控变量带来的影响，为探索复杂疾病诱发提供方向。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种circRNA在系统性红斑狼疮病变免疫异常检测方法。本专利技术是这样实现的，一种circRNA在系统性红斑狼疮病变免疫异常检测方法，所述circRNA在系统性红斑狼疮病变免疫异常检测方法包括以下步骤：第一步，收集外周血单个核细胞PBMCs标本，将样本通过RNA-seq测序技术，从全基因表达谱的角度对基因表达情况进行了全方位的检测分析。第二步，挑选出20个存在显著性差异的基因，上调10个，下调10个。第三步，基于circRNA参与转录后调控，使用circmiR1.0软件对候选基因进行匹配分析，将所有存在靶向结合的miRNA挑选出来。第四步，通过对靶向结合的miRNA归纳总结，结合文献报道筛选出SLE当中具有代表的miRNA。第五步，验证circRNA吸附miRNA调控下游靶基因和信号通路的表型影响。第六步，分别从circRNA吸附miRNA结合的蛋白复合物互作及调控的转录因子角度对上述靶基因和信号通路进行机制研究。进一步，所述circRNA在系统性红斑狼疮病变免疫异常检测方法收集外周血PBMCs提取RNA，使用RNaseR处理排除线性RNA干扰，逆转录cDNA,qPCR检测circRNAs表达，并对产物进行sangersequencing验证。进一步，所述circRNA在系统性红斑狼疮病变免疫异常检测方法收集外周血PBMCs，进行培养，细胞爬片，然后利用设计好的探针进行FISH验证确定其亚细胞定位；进一步，所述circRNA在系统性红斑狼疮病变免疫异常检测方法FISH及荧光素酶活性分析circLOC101928570可作为miRNAs的海绵通过对靶向结合的miRNA进行归纳总结，并筛选出SLE当中具有代表的miRNA；然后通过FISH及荧光报告实验进行后续互作；通过软件比对分析显示circGARS与mir-19a-5p可能存在结合，进行FISH验证；circGARS与mir-19a-5p两者共定位于细胞质，结合前期生信分析SLE发病相关信号通路，初步得出circGARS潜在信号轴即为：circGARS通过吸附miR-19a-5p调节泛素-编辑酶A20负反馈调节激活NFKB通路介导SLE免疫炎症反应；circGARS与Ago2存在潜在结合：通过RIP-qPCR实验验证circGARS与Ago2存在结合。进一步，所述circRNA在系统性红斑狼疮病变免疫异常检测方法利用3D计算机circGARS与Ago2的帽子结构m7GPPPN存在结合，帽子结构是指在真核生物中转录后修饰形成的成熟mRNA在5'端的一个特殊结构，即m7GPPPN结构，又称为甲基鸟苷帽子；mRNA5’-端帽子结构是mRNA翻译起始的必要结构，对核糖体对mRNA的识别提供了信号，协助核糖体与mRNA结合，使翻译从AUG开始。进一步，所述circRNA在系统性红斑狼疮病变免疫异常检测方法circGARS通过吸附miR-19a-5p调节泛素-编辑酶A20负反馈调节激活NFKB通路介导SLE免疫炎症反应。进一步，所述circRNA在系统性红斑狼疮病变免疫异常检测方法基于3D计算机模拟模型，利用生物素标记体外合成修饰基因circGARS表达结合RNApulldown研究结合蛋白Ago2组成的三元复合物对靶基因A20转录表达；circLOC101928570靶向miR-150的两个成熟体miR-150-3p/5p，而前期查阅文献文献miR-150在SLE患者T淋巴细胞中是高表达的；通过转录因子预测软件对转录因子MYB靶基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种circRNA在系统性红斑狼疮病变免疫异常检测方法，其特征在于，所述circRNA在系统性红斑狼疮病变免疫异常检测方法包括以下步骤：/n第一步，收集外周血单个核细胞PBMCs标本，将样本通过RNA-seq测序技术，从全基因表达谱的角度对基因表达情况进行了全方位的检测分析；/n第二步，挑选出20个存在显著性差异的基因，上调10个，下调10个；/n第三步，基circRNA参与转录后调控，使用circmiR1.0软件对候选基因进行匹配分析，将所有存在靶向结合的miRNA挑选出来；/n第四步，通过对靶向结合的miRNA归纳总结，结合典型文献报道筛选出SLE当中具有代表的miRNA；/n第五步，验证circRNA吸附miRNA调控下游靶基因和信号通路的表型影响；/n第六步，分别从circRNA吸附miRNA结合的蛋白复合物互作及调控的转录因子角度对所述靶基因和信号通路进行机制研究。/n

【技术特征摘要】
1.一种circRNA在系统性红斑狼疮病变免疫异常检测方法，其特征在于，所述circRNA在系统性红斑狼疮病变免疫异常检测方法包括以下步骤：
第一步，收集外周血单个核细胞PBMCs标本，将样本通过RNA-seq测序技术，从全基因表达谱的角度对基因表达情况进行了全方位的检测分析；
第二步，挑选出20个存在显著性差异的基因，上调10个，下调10个；
第三步，基circRNA参与转录后调控，使用circmiR1.0软件对候选基因进行匹配分析，将所有存在靶向结合的miRNA挑选出来；
第四步，通过对靶向结合的miRNA归纳总结，结合典型文献报道筛选出SLE当中具有代表的miRNA；
第五步，验证circRNA吸附miRNA调控下游靶基因和信号通路的表型影响；
第六步，分别从circRNA吸附miRNA结合的蛋白复合物互作及调控的转录因子角度对所述靶基因和信号通路进行机制研究。


2.如权利要求1所述的circRNA在系统性红斑狼疮病变免疫异常检测方法，其特征在于，所述circRNA在系统性红斑狼疮病变免疫异常检测方法收集外周血PBMCs提取RNA，使用RNaseR处理排除线性RNA干扰，逆转录cDNA,qPCR检测circRNAs表达，并对产物进行sangersequencing验证。


3.如权利要求1所述的circRNA在系统性红斑狼疮病变免疫异常检测方法，其特征在于，所述circRNA在系统性红斑狼疮病变免疫异常检测方法收集外周血PBMCs，进行培养，细胞爬片，然后利用设计好的探针进行FISH验证确定其亚细胞定位。


4.如权利要求1所述的circRNA在系统性红斑狼疮病变免疫异常检测方法，其特征在于，所述circRNA在系统性红斑狼疮病变免疫异常检测方法FISH及荧光素酶活性分析circLOC101928570可作为miRNAs的海绵通过对靶向结合的miRNA进行归纳总结，并筛选出SLE当中具有代表的miRNA；然后通过FISH及荧光报告实验进行后续互作；通过软件比对分析显示circGARS与miR-19a-5p可能存在结合，进行FISH验证；
circGARS与miR-19a-5p两者共定位于细胞质...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵兴旺，倪兵，游弋，郭俊恺，张龙龙，葛兰，王娟，王春又，赵承磊，刘文英，吴奇俊，高翠娥，宋志强，
申请(专利权)人：中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：重庆;50