SMA致病基因捕获试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术公开了SMA致病基因捕获试剂盒及其应用。本发明专利技术提供了一种SMA致病基因捕获的捕获探针，为如下1)或2)：1)其由序列表中序列1至序列39所示的探针组成；2)由1)中每条探针的衍生物组成；所述每条探针的衍生物为将1)中每条探针经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的探针。本发明专利技术提供SMA致病基因捕获试剂盒，能够提高对SMN1基因和SMN2基因拷贝数检测的特异性，通量高、准确度高、成本低，解决了现有方法测序深度不均一、错误率高等问题，从而实现对SMA致病基因患者和携带者的筛查。

【技术实现步骤摘要】
SMA致病基因捕获试剂盒及应用
本专利技术属于基因检测领域，具体涉及SMA致病基因捕获试剂盒及其应用。
技术介绍
脊髓性肌萎缩症(SpinalMuscularAtrophy,SMA)是一种常染色体隐性遗传的神经肌肉病,发病率为1/5000-1/10000，高居致死性常染色体遗传病的第二位，携带者频率为1/35-1/80。SMA临床特征表现为肌肉萎缩、肌张力低、腱反射减弱等。SMA可分为4类，I型(严重型)、II型(中间型)、III型(轻型)和IV型(成人型)。目前遗传学已经确认，SMA主要与两个高度同源的基因密切相关，SMN1与SMN2，二者之间只有5个碱基的差别，全长约20kb，含9个外显子，转录产物约1.7kb，编码294个氨基酸。由于SMA区域含有一个复杂的反向重复序列，高度不稳定，导致该区域经常发生缺失和基因转换，研究表明，95-98％SMA患者SMN1的7号外显子发生了纯合缺失，3-5％SMA患者的一条染色体发生点突变，另一条染色体发生缺失或基因转换。目前，临床上常用于SMA基因检测的方法主要有以下几类：(1)PCR-RFLP或一代测序，该方法操作简便，但只能检测纯合型缺失，不能区分携带者及正常人，也不能检测SMN2的拷贝数，在临床上仅可以诊断SMN1纯合缺失的患者，其他情况只能作为初筛。(2)荧光定量PCR，该方法多采用单内参标准化，定量检测结果判断存在一定的主观因素，可以区分患者，携带者、正常人，但是其它如SMN1点突变和2+0基因型携带者不能检测。(3)多重连接探针扩增技术(multiplexligation-dependentprobeamplification,MLPA)，该技术可以明确区分患者、携带者及正常人，同时检测患者的SMN2拷贝数。但是该技术操作时间较长，成本较高，操作过程中有多步开盖操作，增加污染风险。且不能检测点突变与特殊的SMN12+0携带者。(4)二代测序，该方法已有专利可以检测SMN1和SMN2的点突变。但该方法(扩增子测序)由于PCR的偏好性会使目标区域的测序深度不均一，且对于碱基多聚体(homopolyer)和插入缺失具有较高的测序错误率，因而不能有效地用来检测SMN1/2的拷贝数变异。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种SMA致病基因捕获的捕获探针。本专利技术提供的捕获探针，为如下1)或2)：1)其由序列表中序列1至序列39所示的探针组成；2)由1)中每条探针的衍生物组成；所述每条探针的衍生物为将1)中每条探针经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的探针。上述捕获探针中，所述每条探针均标记生物素。本专利技术另一个目的是提供一种SMA致病基因捕获的试剂盒。本专利技术提供的试剂盒，包括上述的捕获探针所示的组分1)。上述试剂盒还包括如下独立包装的各个组分中至少一种：2)富集缓冲液BL，包括人cot-1DNA、鲑鱼精DNA、引物1和引物2；具体由30％-45％(体积百分比)人cot-1DNA(如30％-35％、35％-45％、30％、35％、40％或45％)、5％-25％(体积百分比)鲑鱼精DNA(如5％-15％、15％-25％、5％、10％、15％、20％或25％)、0.2-1nmol/μl引物1(如0.2-0.5nmol/μL、0.5-1nmol/μL、0.2nmol/μL、0.3nmol/μL、0.5nmol/μL、0.6nmol/μL或1nmol/μL)、0.2-1nmol/μl引物2(如0.2-0.5nmol/μL、0.5-1nmol/μL、0.2nmol/μL、0.3nmol/μL、0.5nmol/μL、0.6nmol/μL或1nmol/μL)和水组成；所述引物1的核苷酸序列为序列40；所述引物2的核苷酸序列为序列41；3)富集缓冲液HY，包括NaCl、柠檬酸钠、BSA和Tween20；具体其由1.0-1.5M(如1.0-1.25M、1.25-1.5M、1M、1.25M或1.5M)NaCl、0.1-0.3M柠檬酸钠(如0.1-0.15M、0.15-0.3M、0.1M、0.125M、0.15M、0.2M或0.3M)、0.08-0.12g/100mL(如0.08-0.10g/100mL、0.10-0.12g/100mL、0.08g/100mL、0.10g/100mL或0.12g/100mL)BSA、5％-10％(如5-7％、7-10％、5％、6％、7％、8％或9％)(体积比)Tween20和水组成；4)文库富集结合缓冲液，包括NaCl、EDTA和Tris-HCl缓冲液；具体由1MNaCl、1mMEDTA和pH7.5、10mM的Tris-HCl缓冲液组成；5)洗涤缓冲液WB1，包括SDS和柠檬酸三钠缓冲液；其为质量体积比0.05-0.2％的SDS溶液A(0.05-0.1％、0.1-0.2％、0.05％、0.1％、0.2％)；SDS溶液A中的溶质为SDS，溶质为质量体积比0.05-0.2％(0.05-0.1％、0.1-0.2％、0.05％、0.1％、0.2％)的SDS；溶剂为柠檬酸三钠缓冲液SSC；所述柠檬酸三钠缓冲液SSC由175g/LNaCl、88g/L柠檬酸三钠和水组成，所述缓冲液pH为7.4；6)洗涤缓冲液WB2，包括SDS和10倍稀释的所述柠檬酸三钠缓冲液；其为质量体积比0.05-0.2％(0.05-0.1％、0.1-0.2％、0.05％、0.1％、0.2％)SDS溶液B；SDS溶液B中的溶质为SDS(0.05-0.1％、0.1-0.2％、0.05％、0.1％、0.2％)，溶质为质量体积比0.05-0.2％，溶剂为0.1×SSC；所述0.1×SSC为将所述柠檬酸三钠缓冲液SSC稀释10倍，得到的溶剂；所述0.1×SSC的pH值为7.4；7)文库富集洗脱液，其为0.1MNaOH水溶液；8)中和缓冲液NE，其为pH值为7.5且浓度为1MTris-HCl水溶液；9)PCR反应液，包括引物3和引物4；所述引物3的核苷酸序列为序列42，所述引物4的核苷酸序列为序列43，且所述引物3和所述引物4最后一位核苷酸均为硫代修饰；上述试剂盒还包括记载如下判断标准的可读载体：根据测序结果与人类基因组版本Hg19中的SMN1基因和SMN2基因比对，计算待测样本中SMN1基因的f(Z)值和SMN2基因的f(Z)值，来判断待测样本中SMN1基因和SMN2基因的拷贝数，从而确定待测样本是否为脊髓性肌萎缩症患者或脊髓性肌萎缩症携带者，具体如下：SMN1基因的f(Z)＝B/所有阴性样本B值的中位数B＝样本在SMN1基因的测序深度D/比对碱基数A其中，D值表示单个样本的SMN1基因的测序深度，A值表示单个样本SMN1基因的比对碱基数，B值为D与A的比值；SMN2基因的f(Z)＝B/所有阴性样本B值的中位数B＝样本在SMN2基因的测序深度D/比对碱基数A其中，D值表示单个样本本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种SMA致病基因捕获的捕获探针，为如下1)或2)：/n1)其由序列表中序列1至序列39所示的探针组成；/n2)由1)中每条探针的衍生物组成；/n所述每条探针的衍生物为将1)中每条探针经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的探针。/n

【技术特征摘要】
1.一种SMA致病基因捕获的捕获探针，为如下1)或2)：
1)其由序列表中序列1至序列39所示的探针组成；
2)由1)中每条探针的衍生物组成；
所述每条探针的衍生物为将1)中每条探针经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的探针。


2.根据权利要求1所述的捕获探针，其特征在于：所述每条探针均标记生物素。


3.一种SMA致病基因捕获的试剂盒，包括权利要求1或2所述的捕获探针所示的组分1)。


4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括如下独立包装的各个组分中至少一种：
2)富集缓冲液，其包括人cot-1DNA、鲑鱼精DNA、引物1和引物2；
所述引物1的核苷酸序列为序列40；
所述引物2的核苷酸序列为序列41；
3)富集缓冲液，包括NaCl、柠檬酸钠、BSA和Tween20；
4)文库富集结合缓冲液，包括NaCl、EDTA和Tris-HCl缓冲液；
5)洗涤缓冲液WB1，包括SDS和柠檬酸三钠缓冲液；
6)洗涤缓冲液WB2，包括SDS和10倍稀释的所述柠檬酸三钠缓冲液；
7)文库富集洗脱液，其为NaOH水溶液；
8)中和缓冲液NE，其为Tris-HCl缓冲液；
9)PCR反应液，包括引物3和引物4；
所述引物3的核苷酸序列为序列42，所述引物4的核苷酸序列为序列43，且所述引物3和所述引物4最后一位核苷酸均为硫代修饰。


5.权利要求1或2所述的捕获探针或权利要求3或4所述的试剂盒在制备捕获待测样本中SMA致病基因的产品中的应用。


6.权利要求1或2所述的捕获探针或权利要求3或4所述的试剂盒在制备检测待测样本中SMA致病相关基因绝对拷贝数的...

【专利技术属性】
技术研发人员：伍建，姬晓雯，王海丽，
申请(专利权)人：迈基诺重庆基因科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：重庆;50