抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭和转移及促进凋亡的基因制造技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，公开了一种抑制乳腺癌细胞的增殖，侵袭和转移及促进凋亡的基因，基因为NR_026882。本发明专利技术通过荧光定量PCR检测正常乳腺上皮细胞MCF‑10A以及乳腺癌细胞中LncRNA‑DKFZP434K028表达情况，与正常乳腺上皮细胞MCF‑10A相比，LncRNA‑DKFZP434K028在乳腺癌细胞中的表达明显上调，在高侵袭性细胞MDA‑MB‑231中的表达量最高，在低侵袭性细胞MCF‑7中表达量最低。敲除LncRNA‑DKFZP434K028可抑制乳腺癌细胞MDA‑MB‑231增殖、侵袭能力并促进MDA‑MB‑231的凋亡。本发明专利技术对于乳腺癌的诊断和治疗有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭和转移及促进凋亡的基因
本专利技术属于基因工程
，尤其涉及一种抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭和转移及促进凋亡的基因。
技术介绍
女性乳腺是由皮肤、纤维组织、乳腺腺体和脂肪组成的，乳腺癌是发生在乳腺腺上皮组织的恶性肿瘤。乳腺癌中99％发生在女性，男性仅占1％。乳腺并不是维持人体生命活动的重要器官，原位乳腺癌并不致命；但由于乳腺癌细胞丧失了正常细胞的特性，细胞之间连接松散，容易脱落。癌细胞一旦脱落，游离的癌细胞可以随血液或淋巴液播散全身，形成转移，危及生命。目前乳腺癌已成为威胁女性身心健康的常见肿瘤。全球乳腺癌发病率自20世纪70年代末开始一直呈上升趋势。美国8名妇女一生中就会有1人患乳腺癌。中国不是乳腺癌的高发国家，但不宜乐观，近年我国乳腺癌发病率的增长速度却高出高发国家1～2个百分点。据国家癌症中心和卫生部疾病预防控制局2012年公布的2009年乳腺癌发病数据显示：全国肿瘤登记地区乳腺癌发病率位居女性恶性肿瘤的第1位，女性乳腺癌发病率(粗率)全国合计为42.55/10万，城市为51.91/10万，农村为23.12/10万。乳腺癌已成为当前社会的重大公共卫生问题。自20世纪90年代全球乳腺癌死亡率呈现出下降趋势；究其原因，一是乳腺癌筛查工作的开展，使早期病例的比例增加；二是乳腺癌综合治疗的开展，提高了疗效。乳腺癌已成为疗效最佳的实体肿瘤之一。综上所述，现有技术存在的问题是：(1)现有技术中，不能为乳腺癌细胞中的表达、高侵袭性细胞MDA-MB-231中的表达、低侵袭性细胞MCF-7中的表达提供理论依据。(2)现有技术不能准确抑制乳腺癌的增殖、侵袭和转移。临床上对于乳腺癌的治疗达不到抑制增殖，侵袭和转移的效果，不能提高病人的生存率。我们的技术为临床靶基因的治疗提供理论依据。(3)LncRNA可以调控编码蛋白，研究LncRNA对乳腺癌增殖，侵袭转移的影响有助于揭示乳腺癌侵袭和转移的分子机制从而有助于筛选用出乳腺癌诊断及判断预后的生物标记物，同时可以设计有效的抗乳腺癌增殖侵袭转移的分子靶向药物。解决上述技术问题的难度：寻找一种能有效抑制乳腺癌细胞侵袭和转移的精准靶向药物。解决上述技术问题的意义：(1)提供一种筛选抑制乳腺癌侵袭转移的潜在的靶向药物，此药物可以通过抑制LncRNA调控的蛋白起到抑制乳腺癌侵袭转移的作用。(2)提供一种治疗乳腺癌的药物，实现乳腺癌的精准分子治疗。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种抑制乳腺癌细胞增殖、侵袭和转移及促进凋亡的基因。本专利技术是这样实现的，一种抑制乳腺癌细胞增殖、侵袭和转移及促进凋亡的基因，所述抑制乳腺癌细胞增殖、侵袭和转移及促进凋亡的基因为NR_026882即LncRNA-DKFZP434K028。进一步，长链非编码RNA是不具有编码蛋白质能力的RNA，长度大于200nt；LncRNA-DKFZP434K028位于chr11染色体，长度为936nt，GeneID为lnc-TMEM258-3。本专利技术的另一目的在于提供一种所述抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭和转移及促进凋亡的基因的检测方法，所述抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭和转移及促进凋亡的基因的检测方法包括以下步骤：第一步，细胞中LncRNA-DKFZP434K028的表达：通过荧光定量PCR检测正常乳腺上皮细胞MCF-10A以及乳腺癌细胞MDA-MB-231，MCF-7，T47D中LncRNA-DKFZP434K028的表达情况；进一步，长链非编码RNA是不具有编码蛋白质能力的RNA，长度大于200nt；LncRNA-DKFZP434K028位于chr11染色体，长度为936nt，GeneID为lnc-TMEM258-3。本专利技术的另一目的在于提供一种所述抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭和转移及促进凋亡的基因的检测方法，所述抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭和转移及促进凋亡的基因的检测方法包括以下步骤：第一步，细胞中LncRNA-DKFZP434K028的表达：通过荧光定量PCR检测正常乳腺上皮细胞MCF-10A以及乳腺癌细胞MDA-MB-231，MCF-7，T47D中LncRNA-DKFZP434K028的表达情况；第二步，慢病毒感染细胞：通过shRNA慢病毒感染乳腺癌细胞MDA-MB-231，成功敲除细胞中的LncRNA-DKFZP434K028，并筛选出稳转细胞株，感染RNAi慢病毒的MDA-MB-231细胞称为shDKFZP434K028，感染对照慢病毒MDA-MB-231细胞称为shCtrl；第三步，CCK8试剂盒检测细胞增殖：CCK8试剂盒检测感染前后细胞的增殖能力，结果显示敲除LncRNA-DKFZP434K028可抑制MDA-MB-231细胞的增殖能力；第四步，细胞划痕检测实验检测感染前后细胞的侵袭能力，敲除LncRNA-DKFZP434K028抑制MDA-MB-231细胞的侵袭能力。第五步，流式细胞仪检测感染前后细胞的凋亡情况，敲除LncRNA-DKFZP434K028促进MDA-MB-231细胞的凋亡。进一步，所述第一步细胞中LncRNA-DKFZP434K028的表达的荧光定量PCR包括：步骤一，细胞中总RNA的提取；步骤二，应用M-MLV逆转录酶合成第一链cDNA；步骤三，用Bio-Rad的SYBRGreen荧光定量PCR试剂盒检测细胞中LncRNA-DKFZP434K028的表达量。进一步，所述步骤一细胞中总RNA的提取具体包括：(1)吸尽6孔板中正常乳腺上皮细胞MCF-10A或乳腺癌细胞MDA-MB-231，MCF-7,T47D细胞的培养液，每孔加入1mLTRIzol，使其覆盖细胞，再用吸管或加样器吹打3次，细胞应完全裂解，转移至离心管中；(2)在装有裂解物的离心管中加入0.2mL的氯仿，振荡器上充分振荡混匀20秒，室温放置5分钟；2000g4℃离心10分钟，吸取含总RNA的上层水相至一新的离心管中，每毫升TRIzol吸取0.6mL上层水相；(3)加入和上层水相等体积的异丙醇，颠倒数次混匀，室温沉淀5分钟。12000g4℃离心10分钟，在管底可见RNA沉淀；弃上清，按每毫升TRIzol加入1mL75％乙醇，颠倒混匀，以清洗RNA沉淀；12000g4℃离心2分钟；室温倒置晾干5-10分钟；(4)加入DEPC处理水使RNA沉淀溶解；存放于-80℃。进一步，所述步骤三用2–△△CT法计算LncRNA-DKFZP434K028的相对表达量；LncRNA-DKFZP434K028引物序列如下：forwardprimer：5’-CCACATACTCCAGCACCCAA-3’，reverseprimer：5’-TCTTCACGGACCTAGCACCTT-3’。GAPDH作为内参照。进一步，所述第二步慢病毒感染细胞具体包括：(1)细胞复苏1)从液氮罐中取出细胞冻存管；<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭和转移及促进凋亡的基因，其特征在于，所述抑制乳腺癌细胞的侵袭和转移的基因为LncRNA-DKFZP434K028，seqname为NR_026882，Gene ID为lnc-TMEM258-3。/n

【技术特征摘要】
1.一种抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭和转移及促进凋亡的基因，其特征在于，所述抑制乳腺癌细胞的侵袭和转移的基因为LncRNA-DKFZP434K028，seqname为NR_026882，GeneID为lnc-TMEM258-3。

<...

【专利技术属性】
技术研发人员：李洪利，尹崇高，孙玉国，周丹丹，
申请(专利权)人：潍坊医学院，
类型：发明
国别省市：山东;37