一种靶向四环素抗性基因tetA的sgRNA及其敲除载体、载体构建方法和应用技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体涉及特异性靶向抗生素抗性基因tetA的sgRNA、含有该sgRNA的CRISPR/Cas9基因敲除载体及其构建方法和应用，即一种靶向四环素抗性基因tetA的sgRNA及其敲除载体、载体构建方法和应用。本发明专利技术通过对四环素类抗性基因tetA的序列分析，筛选出靶向切割tetA基因的上述sgRNA序列。经实验验证，本发明专利技术提供的CRISPR/Cas9敲除载体能够高效靶向切割tetA基因第251位至第270位序列。

【技术实现步骤摘要】
一种靶向四环素抗性基因tetA的sgRNA及其敲除载体、载体构建方法和应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及特异性靶向抗生素抗性基因tetA的sgRNA、含有该sgRNA的CRISPR/Cas9基因敲除载体及其构建方法和应用。
技术介绍
近年来，随着抗生素在畜禽养殖和临床治疗中的大量使用，环境中抗生素抗性细菌以及抗生素抗性基因的丰度正在不断增加。抗生素抗性基因会使细菌产生抗生素耐药性，目前已被当做一种新型的环境污染物。四环素类抗生素是由放线菌产生的或半合成的一类广谱抗生素，由于价格低廉，不仅被作为药物用于治疗人类或动物的细菌感染，同时也被作为常用的饲料添加剂，用于提高饲料利用率，促进养殖动物的生长。四环素的滥用导致了四环素抗性基因在细菌间广泛传播，这使得四环素的治疗效果不断被削弱，对人和动物有着潜在的健康风险。tetA基因是四环素抗性基因中的重要一种，目前在土壤，地表水，大气，污水处理厂、沉积物等环境中都被广泛检出。目前，抗生素抗性基因的削减主要是通过微生物群落结构的改变，例如，通过过滤的方式减少微生物的生物量。但这些方式都没有从根本上破坏抗性基因，系统中残余的抗性基因仍能通过整合、转座以及接合转移等途径进行迁移转化。CRISPR/Cas9系统是近年来新兴的基因编辑技术，Cas9蛋白能在特定guide-RNA的引导下靶向切割特定序列。一些研究者利用CRISPR/Cas9系统对大肠杆菌等多种微生物的功能基因进行了敲除，但目前利用该系统对四环素抗性基因敲除的研究还较为缺乏。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供特异性靶向四环素抗性基因tetA的sgRNA、含有该sgRNA的CRISPR/Cas9基因敲除载体及其构建方法。第一方面，本专利技术所涉及的sgRNA序列靶向tetA基因的第251位至第270位序列，Cas9蛋白在该sgRNA的引导下对该位点有良好的切割效果，该sgRNA的特异性核苷酸序列如sgRNA-1(为SEQIDNo.1)所示。sgRNA-1：5’-CATGATGGCGTAGTCGACAG-3’。第二方面，本专利技术提供了包含上述特异性靶向tetA基因第251至第270位核苷酸序列的sgRNA的CRISPR/Cas9基因敲除载体，优选的，CRISPR/Cas9基因敲除载体图谱如附图3所示。上述CRISPR/Cas9基因敲除载体为单质粒系统，即运用同一个质粒载体表达基因敲除所需要的Cas9蛋白和sgRNA。第三方面，本专利技术提供上述CRISPR/Cas9基因敲除载体的构建方法，其为：将Cas9蛋白基因，上述sgRNA基因，接合转移位点，复制子，筛选标记基因通过无缝克隆的方法得到上述的CRISPR/Cas9基因敲除载体。上述CRISPR/Cas9基因敲除载体的构建包含以下步骤：(1)合成含有上述sgRNA序列的表达元件sgRNA(tetA)，该表达元件包含原核生物J23119(SpeI)启动子、上述sgRNA序列、gRNAscaffold序列和终止子序列，其序列如SEQIDNo.2所示(序列如下)：CTGCAGCACGTACAGCACTGATGCATCGCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGCTGGATCCTTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATACTAGTCATGATGGCGTAGTCGACAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTGAATTCTCTAGAGTCGACCTGCAGAAGCTTAGATCTATTACCCTGTTATCCCTGCAG(2)将步骤(1)合成的sgRNA(tetA)插入到puc57载体中，得到载体puc57-sgRNA(tetA)，其图谱如图1所示。(3)以pk18mobsacB质粒为模板，利用引物对1PCR扩增RP4-oriT序列，其中RP4-oriT序列中包含接合转移位点，将扩增产物凝胶纯化。(4)以步骤(2)中puc57-sgRNA(tetA)为模板，利用引物对2PCR扩增oriV-sgRNA(tetA)序列，将扩增产物凝胶纯化。(5)步骤(3)、(4)所涉及的引物对1、2含有同源片段，利用无缝克隆将步骤(3)、(4)纯化所得的扩增产物连接，得到puc57-oriT-sgRNA(tetA)质粒，其图谱如图2所示。(6)以pCas质粒为模板，利用引物对3PCR扩增Cas9-Kan序列，将扩增产物凝胶纯化。(7)以步骤(5)所得的puc57-oriT-sgRNA(tetA)为模板，利用引物对4PCR扩增oriV-oriT-sgRNA(tetA)序列，将扩增产物凝胶纯化。(8)步骤(6)、(7)所涉及的引物对3、4含有同源片段，利用无缝克隆将步骤(6)、(7)纯化所得的扩增产物连接，得到puc57-oriT-Cas9-sgRNA(tetA)质粒，其图谱如图3所示，该质粒即为靶向tetA基因第251位至第270位序列的CRISPR/Cas9基因敲除载体。引物对1：OriT-S:CTGGAGGATCATCCAGCCCTGOriT-F:GCCGAGCTTCCTGCTGAACATC引物对2Puc19-F:GATGTTCAGCAGGAAGCTCGGCCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGPuc19-S:ATCAGGGCTGGATGATCCTCCAGTCATTAATGCAGCTGGCACGAC引物对3：Fragment-F:ATCTCAGCGATCCAGGTCATTCAGACTGGCTAATGCFragment-S:GATGATCCTCCAGGATGTAGCCGTCAAGTTGTCAT引物对4：Vector-F:GACGGCTACATCCTGGAGGATCATCCACGTACAGCACTGATGCATCGVector-S:TCTGAATGACCTGGATCGCTGAGATAGGTGCCTC同样地，本专利技术利用PCR扩增，无缝克隆的方法获得puc57-oriT-Cas9-△sgRNA质粒，其图谱如图4所示，该质粒与puc57-oriT-Cas9-sgRNA(tetA)相比缺少含有上述sgRNA的sgRNA(tetA)序列，无法行使基因敲除的功能，而puc57-oriT-Cas9-sgRNA(tetA)可以行使敲除功能。上述所涉及的PCR反应采用50ul体系，反应体系如下：PrimeSTARMaxPremix25ul，上下游引物各1ul，模板1ul，ddH2O22ul。上述所涉及的PCR反应程序如下：98℃变性10s，55℃退火10s，延伸温度为72℃，速度为5s/kb，循环数为30。上述所涉及的无缝克隆反应体系如下：NovoRecplus重组酶1ul，5×缓冲液本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.特异性靶向抗生素抗性基因tetA的sgRNA，其特征在于，该sgRNA靶向tetA基因的第251位至第270位的序列。/n

【技术特征摘要】
1.特异性靶向抗生素抗性基因tetA的sgRNA，其特征在于，该sgRNA靶向tetA基因的第251位至第270位的序列。


2.根据权利要求1所述的特异性靶向tetA基因的sgRNA，其特征在于，其编码基因的核苷酸序列为SEQIDNo.1：5’-CATGATGGCGTAGTCGACAG-3’。


3.含有权利要求1或2所述的特异性靶向tetA基因的sgRNA的CRISPR/Cas9基因敲除载体。


4.根据权利要求3所述的CRISPR/Cas9基因敲除载体，其特征在于，其图谱如图3所示。


5.一种构建权利要求3或4所述的CRISPR/Cas9基因敲除载体的方法，其特征在于，包括：
(1)根据权利要求1或2所述靶向切割tetA基因的sgRNA，合成含有该sgRNA的表达元件sgRNA(tetA)，该表达元件sgRNA(tetA)包含原核生物J23119(SpeI)启动子、编码基因的核苷酸序列为：5’-CATGATGGCGTAGTCGACAG-3’的sgRNA、gRNAscaffold序列和终止子序列，其序列如SEQIDNo.2；将该表达元件sgRNA(tetA)插入到puc57载体中，得到载体puc57-sgRNA(tetA)；
(2)利用无缝克隆技术在上述(1)所述的puc57-sgRNA(tet...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈红，林泽俊，朱琳，周振超，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33