抑制HMGB1基因的siRNA、包载siRNA的稳定核酸脂质纳米粒及其应用制造技术

本发明专利技术提供了抑制HMGB1基因的siRNA、包载siRNA的稳定核酸脂质纳米粒及其应用，所述的siRNA分子的正义链为SEQ ID NO：1，反义链为SEQ ID NO：2。本发明专利技术具有如下技术效果：本发明专利技术将针对HMGB1的siRNA包载在稳定核酸脂质纳米粒中，避免其被体内酶降解，制备的纳米粒具有显著性的抗炎效果，可以将针对HMGB1的siRNA靶向递送到肝巨噬细胞释放，增强抗炎的效果，从而更好地治疗NASH。

【技术实现步骤摘要】
抑制HMGB1基因的siRNA、包载siRNA的稳定核酸脂质纳米粒及其应用
本专利技术涉及能够有效沉默NASH模型中HMGB1表达的siRNA、包载siRNA的稳定核酸脂质纳米粒及其应用，属于医药

技术介绍
在西方国家，非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是最常见的慢性肝病，NAFLD包括单纯性脂肪肝，非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholicsteatohepatitis，NASH)以及与其相关的纤维化、肝硬化甚至肝癌。NASH是脂肪肝疾病的一种更具侵略性的形式，可以发展为肝硬化和肝硬化并发症，包括肝衰竭和肝细胞癌,并且预计将成为未来十年肝移植的最常见适应症。与酒精性肝炎不同的是，NASH患者没有过往饮酒史，组织学上以脂肪变性、炎症、肝细胞损伤或伴有肝纤维化为特征。此外，据报道与参考人群相比，NASH患者的生存率降低，心血管和肝脏相关原因导致的死亡率更高。目前临床上针对此病的治疗大多为基于包括糖尿病在内的代谢综合征治疗基础上的延伸，并无显著的治疗效果，目前尚无药物通过FDA的批准用于NASH的治疗。由于其致病机制复杂，目前还没有统一的概念来描述NASH的致病机制，学术界广泛认可的机制是“二次打击”学说。这一学说认为在疾病的起始阶段，肝脏脂肪沉积是第一重打击，表现为肝脏三酰甘油聚集和胰岛素抵抗，当肝脏受到其他因素(如炎症细胞因子大量释放、线粒体损伤和氧化应激等)带来的“二重打击”时会加重NASH的进展。在NASH疾病进展阶段，细胞内以及表面识别受体是识别细胞损伤和病菌入侵的关键。对于慢性肝损伤而言，在没有病原体和抗原刺激下产生的炎症反应是病情进展的关键发生机制,尤其在NASH中,在机体正常的情况下，DAMPS存在于细胞内，但是当细胞活化或者损伤时则主动分泌或被动释放到胞外，并且可以通过细胞表面的模式识别受体激活巨噬细胞参与机体的炎症反应。目前已经明确的DAMPS的家族分子包括HMGB1、细胞核和线粒体DNA及尿酸等，其中HMGB1在NASH炎症发展中起到显著作用。HMGB1是一种高度保守的核蛋白，广泛分布在哺乳动物细胞中。在NASH疾病中，胰岛素抵抗使血液中游离脂肪酸的浓度增高并且导致肝脏部位大量脂质沉积，使得肝巨噬细胞受损，受损伤的肝巨噬细胞释放大量HMGB1以及其他细胞因子和趋化因子。此外，肝巨噬细胞释放的细胞因子及趋化因子也会招募并激活大量骨髓来源的巨噬细胞至肝内，这些被激活的骨髓来源的巨噬细胞会释放更多的HMGB1和趋化因子，并招募更多的巨噬细胞于肝内，形成一个恶性循环。激活的巨噬细胞不仅会释放促进疾病进展的细胞因子，而且其表面还表达巨噬细胞激活的标志物，例如CD163和甘露糖受体。目前有很多学者通过靶向巨噬细胞及树突状细胞表面的甘露糖受体用于各种疾病的治疗。实现RNAi的有效治疗的前提是将siRNA成功递送到病变部位，避免其被体内的各种酶降解，为此科学家们研发出了一种可以高效递送siRNA的载体，即稳定核酸脂质纳米粒(SNALP)。SNALP一般是由阳离子脂质材料、膜融合脂质材料或PEG-脂质材料、胆固醇等以一定配比构成，能够有效地递送siRNA至患者体内。SNALP包含的聚乙二醇(PEG)修饰的脂质可以减少SNALP聚集并增加体内颗粒循环时间。而且有很多学者通过在其表面修饰不同的抗体、靶向肽和小分子靶向细胞表面受体使其到达不同的病变部位实现靶向治疗，提高治疗效果。2018年8月FDA批准首款小干扰RNA(siRNA)药物Onpattro(patisiran)上市，将RNAi治疗及其制剂形式SNALP推向了一个新的里程碑，进一步促进了核酸类药物的发展。综上所述，靶向巨噬细胞沉默HMGB1蛋白的表达对控制NASH疾病进展可能会起到关键作用，但很少有文章对此问题进行研究。现有技术中存在如下技术问题：缺少一种能够高效靶向巨噬细胞沉默HMGB1蛋白且能更有效地治疗NASH的siRNA。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术提供一种能够抑制HMGB1基因的siRNA、包载siRNA的稳定核酸脂质纳米粒及其应用。专利技术人发现，虽然酒精性脂肪性肝炎对人体产生的危害引起越来越多人的重视与研究，但是很多学者都把研究重点放在抗氧化以及脂质代谢上，却忽略了炎症在NASH疾病进展中的作用，已经有研究结果表明，NASH疾病的严重程度与炎症正相关，可见如果有效控制炎症可能会使NASH疾病得到有效缓解。HMGB1是一种DNA结合核蛋白，是一种重要的晚期致炎因子，与多种炎症性疾病息息相关。在非酒精性脂肪性肝炎疾病中，肝脏部位聚集的大量脂肪会产生脂质过氧化反应，导致肝细胞受损凋亡。细胞凋亡释放各种细胞细胞因子的同时会激活肝巨噬细胞，并募集大量的骨髓来源的巨噬细胞至肝部，巨噬细胞释放的HMGB1是原型损伤相关分子模式，可以通过与不同受体(例如TLRs、RAGE)结合激活NF-κB等信号通路介导炎症反应，可能会促进NASH疾病的进展，导致疾病恶化。专利技术人经过实验证明NASH小鼠肝脏部位HMGB1的含量增高，且与疾病正相关，因此，专利技术人成功构建了靶向肝巨噬细胞的siRNA递送体系(HMGB1-siRNA@SNALP-mannose)用于沉默肝巨噬细胞HMGB1的表达，实验结果表明HMGB1-siRNA@SNALP-mannose通过甘露糖受体的介导可以有效靶向巨噬细胞，并能够有效沉默HMGB1的表达，且实验结果意外地证明，沉默肝巨噬细胞HMGB1的表达，NASH小鼠肝脏部位的肝小叶炎症以及大泡性脂肪病变得到了有效缓解，从而为NASH疾病的治疗提供了一个新的思路。专利技术人设计了一种甘露糖修饰的靶向巨噬细胞的稳定核酸脂质纳米粒(SNALP)用来包载siRNA，即HMGB1-siRNA@SNALP-Mannose，避免其被酶降解以及提高其药物利用率，并将其尾静脉注射于NASH小鼠体内，研究沉默HMGB1蛋白的表达是否会抑制NASH疾病进展。专利技术人使用细胞转染及qPCR和WesternBlot实验筛选出能够高效沉默NASH模型中HMGB1的表达，并使用表面修饰有甘露糖的稳定核酸脂质纳米粒包载siRNA靶向递送至小鼠体内沉默巨噬细胞的HMGB1mRNA的表达，对NASH疾病的进展起到了抑制作用，缓解炎症及大泡性脂肪病变。本专利技术的技术方案如下：本专利技术的抑制HMGB1基因的siRNA，其RNA序列如下：正义链5’-GCUGAAAAGAGCAAGAAAAUU-3’SEQIDNO：1反义链5’-UUUUCUUGCUCUUUUCAGCCU-3’SEQIDNO：2本专利技术的包载有所述siRNA的稳定核酸脂质纳米粒，其制备方法包括如下步骤：(1)制备mannose-SNALP油相，所需的各类脂质材料及重量比如下：DSPE-PEG-mannose：DlinMC3：PEG-DMG：DSPC：Cholesterol＝2：40：3：10：45；将上述脂质材料按照重量配比本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.抑制HMGB1基因的siRNA，其特征在于，其RNA序列如下：/n

【技术特征摘要】
1.抑制HMGB1基因的siRNA，其特征在于，其RNA序列如下：








正义链
5’-GCUGAAAAGAGCAAGAAAAUU-3’SEQIDNO：1


反义链
5’-UUUUCUUGCUCUUUUCAGCCU-3’SEQIDNO：2






。


2.包载有权利要求1所述的siRNA的稳定核酸脂质纳米粒，其特征在于，其制备方法，包括如下步骤：
(1)制备mannose-SNALP油相，所需的各类脂质材料及重量比如下：
DSPE-PEG-mannose：DlinMC3：PEG-DMG：DSPC：Cholesterol＝2：40：3：10：45...

【专利技术属性】
技术研发人员：俞磊，刘丽，韩宇桥，方小燕，贾裕杰，周靖娥，王依婷，闫志强，王镜，
申请(专利权)人：华东师范大学，
类型：发明
国别省市：上海;31